激光诱导的脉络膜新生血管模型构建中的麻醉剂和激光能量选择

曹乾忠，洪满珠，唐细兰,

(1.中山大学中山眼科中心，眼科学国家重点实验室 510080；2.广州爱尔眼科医院药学部，广州 510060)

脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)存在于许多脉络膜视网膜疾病[1]，其中年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是老年人失明和视力损害的主要病因之一。渗出型AMD以新生血管形成为特征，病理特点主要是 CNV形成后，穿透Bruch's膜进入到通常无血管的视网膜下空间，进而引起视网膜的损害，严重影响视力[2]。De Jong[3]发现尽管只有10%AMD患者发展成新生血管性AMD，但它却是引起90%以上AMD患者中央视力恶化的病因，从而严重影响患者的日常活动。近年来，为研究渗出型AMD的发病机制，研究者建立了许多动物模型，对研究AMD病情的发生发展具有重要意义[4-6]。很多研究[3,7]显示用小鼠作为AMD的研究模型成功率高、机制研究充分、可重复性好，且相关的检查方法成熟。麻醉剂的选择和能量设置是动物CNV模型诱导的关键，为优化构建AMD动物模型，本研究采用Phoenix Micron IV视网膜成像系统自带的532 nm激光器，选择不同激光能量对CNV造模成功率的影响，比较水合氯醛和阿佛丁两种药物对小鼠的麻醉作用，以期望对后期研究提供指导和帮助。

1 材料与方法

1.1 实验动物和药物

C57/BL6小鼠，雌性，6～8周，体重为(20±2) g，来源于广东省实验动物中心[SCXK(粤)2010-0058]，在中山大学中山眼科中心SPF级饲养环境[SYXK(粤)2015-0058]中饲养(伦理编号为2015-118)。使用的药物包括盐酸丙美卡因滴眼液(比利时爱尔康公司)、复方托比卡胺滴眼液(沈阳兴齐眼药股份有限公司)、2%羟丙基甲基纤维素滴眼液(中山大学附属眼科医院制剂)、妥布霉素眼膏(比利时爱尔康公司)、10%荧光素钠注射液[广西梧州制药(集团)股份有限公司]、阿佛丁(日本TCI公司)和阿佛丁溶剂叔戊醇(德国Sigma公司)。

1.2 小鼠分组

小鼠随机分为3组，每组8只，每组设定的激光能量分别为200，300和400 mW，光凝时间为100 ms，激光光斑大小为50 μm。

1.3 小鼠激光光凝诱导的CNV模型的建立

麻醉：小鼠使用4.3%水合氯醛麻醉用量为10 μL/g，1.2%阿佛丁为20 μL/g。

激光视网膜光凝：盐酸丙美卡因滴眼液滴眼1次，复方托比卡胺滴眼液滴眼散瞳2次，2%羟丙基甲基纤维素滴眼液滴眼1次。观察瞳孔散大后利用Phoenix Micron IV视网膜成像系统和激光系统(美国Phoenix研究实验室)，避开血管于小鼠视盘周约2个视盘直径，上、下、左、右各激发1次，共4点/眼；以看到有气泡产生为Bruch's膜击穿特征；完成后涂妥布霉素眼膏1次；小鼠加热垫保温、观察至苏醒。

1.4 荧光素眼底血管造影

分别于光凝后4，7，10，14 d各时间点对小鼠散瞳及麻醉，麻醉方法同前，腹腔内注射100 g/L荧光素钠注射液0.05 mL，行荧光素眼底血管造影检查。

1.5 SD-OCT检查

小鼠麻醉后，用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，盐酸丙美卡因滴眼液滴眼1次，2%羟丙基甲基纤维素眼水滴眼1次。用海德堡OCT仪器SPECTRALIS(德国SPECTRALIS)对小鼠视网膜眼底行OCT检查，着重对激光光凝的斑点进行断层扫描。

1.6 小鼠视网膜、脉络膜铺片和IB4染色

在第14天处死小鼠，以供铺片和IB4染色。颈椎脱臼法处死小鼠，摘除眼球，放入4%多聚甲醛溶液中固定2 h，剥离眼外肌等组织，然后用眼科剪去除角膜结膜和晶状体等结构，只留下视网膜和脉络膜等组织。将视网膜和脉络膜分离，放入到含有10 μg/mL，AF488偶联同工凝集素B4(Isolectin B4，IB4；美国Thermo Scientific公司)的溶液中过夜染色，温度为4 ℃，次日进行视网膜和脉络膜铺片。用荧光显微镜Zeiss Observer A1(德国Zeiss公司)进行荧光观察。

1.7 图像面积计算和统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。图像面积计算用Image Pro Plus 6.0软件，面积大小用像素表示。率的比较用卡方检验；定量资料用均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，两组间比较用t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同麻醉药对C57/BL6小鼠发生白内障的影响

按照Vincent Lambert等[3]的操作步骤使用不同麻醉剂对C57/BL6小鼠进行麻醉，结果显示：相比于阿佛丁，水合氯醛诱导小鼠进入麻醉的时间更长，且麻醉时长更长；阿佛丁的毒性比水合氯醛更大，但麻醉引起的白内障差异无统计学意义(P＞0.05，表1)。

2.2 不同激光能量下CNV造模成功率的比较

使用200，300和400 mW的激光能量造模效果见表2。结果显示：随着激光能量的递增，CNV成功率也逐渐升高。在激光能量达到400 mW时，SDOCT显示视网膜色素上皮被击穿，呈现不连续的状态(图1)。CNV出现的FFA溢漏大小较均一，而且IB4染色面积比较大(图2，3)。FFA染色显示在第4天时渗漏最为明显，随着激光能量的提高，荧光素渗漏区增多。

表1 不同麻醉剂对C57小鼠的影响Table 1 Effect of different anesthetics on C57 mice

表2 不同激光能量CNV造模成功率Table 2 Successful rate of CNV model under different laser energy hierarchy

图1 不同激光能量SD-OCT检查结果Figure 1 SD-OCT results of retinal photocoagulation areas with different laser energy

图2 不同能量造模时激光斑和FFA结果Figure 2 Fundus color photography and FFA results of laser spots with different energy hierarchy

图3 光凝后14 d不同激光能量下的脉络膜平铺片IB4检查结果Figure 3 Comparison of IB4 staining areas of flat-mounted choroid with different laser energy 14 days after laser burn

3 讨论

使用激光诱导CNV能够构建理想的AMD模型[5]。动物模型构建是研究药物治疗CNV的前提。CNV又称视网膜下新生血管，常见于许多眼底疾病，如老年性黄斑变性、特发性脉络膜新生血管和中心性渗出性脉络膜视网膜病变等[8]，是这些疾病的基本病理改变。CNV来自于脉络膜毛细血管，经Bruch's膜入侵，Bruch's膜增厚、破裂以及变性等都是产生CNV的前提条件[9]。CNV的形成经历了血管内皮细胞基底膜降解、内皮细胞增殖、血管基底膜被覆，血管腔形成及周围纤维组织增生等多个病理过程。机体各种新生血管生长因子均可引起血管异常生长，而其中又以血管内皮细胞生长因子及其信号通路尤为重要，起到关键作用[10]，这为临床治疗提供了靶点。CNV常严重损害患者的视力，降低人们的生活质量[11]。

激光能量是CNV造模的关键。激光能量过低，CNV成功率很低，达不到研究的要求；如果能量过高，则会形成一个“固定孔(Solid Hole)”，这为后续用药物治疗CNV的研究带来困扰[7]。Giani等[12]也采用532 nm激光器进行C57小鼠能量梯度的对比试验，分别比较180，240，300及360 mW CNV成功率，发现能量设置为240 mW时成功率最高，这与本研究的400 mW存在差异，可能原因包括房间的湿度、温度、能量传输过程中的衰减及对焦的准确度等，都会影响激光实际作用能量的大小，机器设定的能量值与实际起作用的能量大小存在差异，因此在具体实验时，应该对激光能量进行调整，结合SD-OCT和FFA，确认所在实验室的最佳激光能够量参数。

Lambert等[13]认为水合氯醛会增加C57/BL6患白内障和腹腔脏器粘连的风险，建议用阿佛丁替代。本研究结果显示：水合氯醛不会增加C57/BL6小鼠患不可逆性白内障的发病率，在复苏率和病死率方面两组没有差别；且相对于阿佛丁，水合氯醛小鼠麻醉维持时间长，有利于小鼠实验操作。

综上所述，水合氯醛的麻醉维持时间比阿佛丁长，并未出现加重不可逆性白内障的风险；Phoenix Micron IV视网膜成像系统532 nm激光在400 mW激光能量时，能够做出CNV理想的小鼠AMD动物模型。

致谢

感谢哈佛医学院Gong Yan博士对本课题在实验设计和实验方案的优化上提出宝贵意见。