膀胱癌组织中PAK2表达及对癌细胞活性的影响

韩昵薇 刘兰 段妔 张能 吴涛 罗旭

(遵义医科大学附属医院 1检验科，贵州 遵义 563000；2泌尿外科)

膀胱癌具有增殖快，侵袭能力强的特点，严重威胁患者生命安全〔1〕。放化疗和手术是目前临床治疗膀胱癌的主要手段，但疗效欠佳，高复发率导致患者5年生存率偏低〔2〕。近年来分子生物学的快速发展为膀胱癌的治疗带来了新希望，但由于尚未阐明膀胱癌发生、发展的分子机制，导致缺少膀胱癌诊治的分子标志物〔3〕。Ras相关的C3肉毒素底物(Rac)、细胞分裂周期蛋白(Cdc)42等小分子三磷酸鸟苷(GTP)酶共同构成了肿瘤发生与恶化的信号转导通路，p21激活激酶(PAK)是Rac、Cdc42的作用底物，分为Ⅰ类(PAK1、PAK2、PAK3)、Ⅱ类(PAK4、PAK5)〔4〕。研究者发现，PAK1在肝癌、甲状腺癌、膀胱癌等多种癌症组织和细胞中存在高表达，下调PAK1表达可有效抑制肿瘤的增殖和转移〔5～7〕。本研究通过免疫组化法检测PAK2在膀胱癌组织中的表达，并通过慢病毒载体转染技术在体外构建PAK2基因沉默的膀胱癌细胞株，探讨PAK2表达对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 对象与方法

1.1研究对象 2016年6月至2018年3月行手术治疗的膀胱癌患者108例，其中男80例，女28例；年龄26～82〔平均(62.95±9.30)〕岁；肿瘤直径≤3 cm 72例，>3 cm 36例；病理分级低级别58例，高级别50例；病理分期≤T1期78例，>T1期30例；出现淋巴转移24例。收集膀胱癌组织标本108份，癌旁正常膀胱上皮组织标本24份。本研究经医院伦理委员会批准，患者及其家属签署知情同意书。

1.2材料与主要试剂 人膀胱癌细胞系BIU-87、人正常膀胱上皮细胞系SV-HUC-1购于上海素尔生物科技有限公司；PAK2基因干扰序列(PAK2-shRNA)、无义序列(siRNA)由上海士锋生物科技有限公司合成；慢病毒载体购于上海伯易生物科技有限公司；鼠抗人PAK2 单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G购于北京博尔迈生物技术公司。

1.3免疫组化染色 取标本组织切片，常规脱蜡至水，高压修复抗原，3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，封闭20 min后滴加一抗：鼠抗人PAK2 单克隆抗体，1∶200倍稀释，4℃过夜，滴加HRP标记的羊抗鼠IgG，室温孵育1 h。结果判定：细胞中出现黄色或棕黄褐色为阳性，阳性细胞比例评分标准为：无阳性计0分、阳性细胞比例<25%计1分、25%～50%计2分、51%～75%计3分、>75%计4分。染色强度评分标准：无染色计0分、淡黄色计1分、黄色计2分、棕黄色计3分。以阳性细胞比例评分和染色强度评分之和判断PAK2表达，0～4分为阴性，5～7分为阳性。

1.4细胞培养与转染 BIU-87和SV-HUC-1细胞均放入含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，5%CO237℃培养箱中培养，传至5～6代时用于实验。分别使用含siRNA慢病毒载体(对照组)、PAK2-shRNA慢病毒载体(PAK2基因沉默组)转染BIU-87细胞，继续培养48 h，通过实时荧光-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹验证BIU-87细胞中PAK2 mRNA和蛋白表达情况。

1.5细胞增殖能力检测 制备对照组和PAK2基因沉默组细胞悬液，调整细胞密度至1×105/ml；加入96孔板，100 μl/孔，设置5个平行对照，放入5%CO237℃培养箱中分别培养24、48、72 h，弃去培养液，每孔加入100 μl细胞计数试剂盒(CCK)-8检测液，继续培养4 h，酶标仪读取450 nm波长处的吸光度值。

1.6Transwell细胞迁移和侵袭能力检测 细胞迁移实验：取两组对数期细胞消化、重悬计数后，向上室中加入3×105个细胞，下室加入600 μl DMEM完全培养基，5%CO237℃培养箱中培养48 h；4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色10 min，封片后在光学显微镜下随机选取10个视野计数细胞数量。细胞侵袭实验：基底胶与不含胎牛血清的DMEM培养基按1∶15比例混合，取100 μl加入上室，成胶后加入3×105个细胞，其余步骤同迁移实验。

1.7RT-PCR检测 Trizol提取对照组和PAK2基因沉默组细胞RNA，逆转录得到cDNA。引物序列由南京信帆生物技术有限公司合成，PAK2引物序列：上游5′-AGTAGTAGGAGTAGAAGACTTTGA-3′，下游5′-GACATATGTGTGCCAGACACTAAA-3′；GAPDH引物序列：上游5′-TAGTAGTCGTTACGGAGGAC-3′，下游5′-TTTACTCGGGGTCGGAAG-3′。反应体系30 μl，反应条件：95℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共40个循环，延伸72℃ 5 min。产物行2%琼脂糖凝胶电泳，计算目标条带 mRNA的相对表达量。

1.8Western印迹检测 放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液提取对照组和PAK2基因沉默组细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，各点样孔加入等质量的蛋白样品，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，目标蛋白经湿法电转膜到聚偏氟乙烯膜，封闭后分别滴加鼠抗人PAK2单克隆抗体(1∶200)、鼠抗人GAPDH多克隆抗体(1∶1 000)，4℃过夜，滴加HRP标记的鼠抗人IgG(1∶2 000)，室温孵育1 h，电化学发光显色，暗室中显影，分析各条带灰度值。

1.9统计学分析 采用SPSS19.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1膀胱癌组织中PAK2表达情况 PAK2呈黄色或棕黄色表达于细胞质中，108份膀胱癌组织中PAK2阳性表达56份(51.85%)；24份癌旁正常膀胱上皮组织中PAK2阳性表达2份(8.33%)；膀胱癌组织中PAK2阳性表达率明显高于癌旁正常膀胱上皮组织(P<0.01)。见图1。

图1 PAK2在不同组织中的表达(SP，×200)

2.2不同临床病理指标膀胱癌患者中PAK2阳性率比较 不同肿瘤直径、病理分级、病理分期、淋巴结转移情况的膀胱癌患者中PAK2阳性率差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。其中肿瘤直径>3 cm、病理分级偏高、病理分期>T1、合并淋巴结转移的PAK2阳性率明显偏高。见表1。

表1 不同临床病理指标膀胱癌患者中PAK2阳性率比较〔n(%)〕

2.3PAK2在不同细胞系中表达情况 SV-HUC-1细胞、BIU-87细胞中PAK2 mRNA相对表达量分别为2.36±0.41、4.21±0.63；PAK2蛋白相对表达量分别为1.95±0.28、3.68±0.50。BIU-87细胞中PAK2 mRNA和蛋白相对表达量明显高于SV-HUC-1细胞(P<0.05)。见图2。

图2 不同细胞中PAK2 mRNA的表达

2.4成功构建PAK2基因沉默的人膀胱癌细胞系BIU-87 转染48 h后，对照组、PAK2基因沉默组BIU-87细胞中PAK2 mRNA相对表达量分别为4.18±0.31、0.95±0.17；PAK2蛋白相对表达量分别为3.71±0.28、0.63±0.10。PAK2基因沉默组BIU-87细胞中PAK2 mRNA和蛋白相对表达量明显低于对照组(P<0.01)。见图3。

图3 两组细胞中PAK2蛋白的表达

2.5两组细胞增殖情况分析 转染前两组细胞增殖情况差异无统计学意义(P>0.05)；随着转染时间的延长，对照组和PAK2基因沉默组细胞增殖水平均逐渐增加，转染48 h、72 h 后PAK2基因沉默组细胞增殖情况明显低于对照组(P<0.01)。见表2。

2.6两组细胞迁移和侵袭能力比较 Transwell细胞迁移实验显示，PAK2基因沉默组迁移细胞数〔(20.38±5.72)个〕明显低于对照组〔(56.81±10.95)个,P<0.01〕；细胞侵袭实验显示，PAK2基因沉默组侵袭细胞数〔(14.75±3.90)个〕明显低于对照组〔(36.29±5.70)个，P<0.01〕。见图4。

表2 各组细胞增殖情况分析

图4 Transwell细胞迁移和侵袭实验(×200)

3 讨 论

随着我国人口老龄化加剧，膀胱癌发病率呈快速增长趋势〔8〕；肿瘤细胞的增殖和侵袭是膀胱癌患者病情发展和死亡的主要原因。细胞核分子结构和染色体变化导致抑癌基因活性丧失或下降，原癌基因被激活，相关分子通路活化共同促进了膀胱癌的发生与发展〔9〕。PAK2为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，介导细胞生长、凋亡等多个过程〔10〕。相关研究显示，在胃癌、肝癌等多种恶性肿瘤细胞中均发现PAK2高表达，且PAK2表达水平与肿瘤细胞生长、转移、凋亡明显相关〔11，12〕；但PAK2在膀胱癌组织和细胞中的表达及作用仍鲜有报道。本研究提示PAK2高表达可能介导膀胱癌病情的发展和恶化，监测PAK2表达可用于判断膀胱癌病变程度，评估患者预后水平。

相关研究显示，PAK2可通过上调其下游蛋白细胞外调节蛋白激酶(Erk)、蛋白激酶B(Akt)的表达，促进胃癌细胞增殖〔13〕。结合本研究结果推测沉默PAK2基因可能通过降低Erk、Akt的活性来抑制膀胱癌细胞增殖。

迁移和侵袭是肿瘤细胞的主要生物学特征之一，也是导致多数肿瘤患者死亡的原因，目前仍无较好的防治方法〔14〕；探讨影响肿瘤细胞迁移和侵袭的分子机制对改善患者预后具有重要意义。本研究提示沉默PAK2基因表达可明显抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。相关研究显示，上调PAK2表达可明显提升肝癌细胞的迁移和侵袭能力，其作用机制可能与PAK2高表达激活了细胞外调节蛋白、应激活化蛋白激酶等细胞信号传递中的调控蛋白，介导肝癌细胞的迁移和侵袭过程〔15〕。上述研究与本研究类似，但PAK2基因调控膀胱癌细胞迁移和侵袭的具体分子机制仍需进一步研究。