超声造影剂微泡联合低频超声在肿瘤靶向治疗中的研究进展

徐理敏 王利英

近年来，随着超声医学、分子生物学以及微泡造影剂的发展，超声造影剂微泡联合低频超声的生物学效应用于临床治疗得到了广泛关注，已成为肿瘤治疗研究的一大热点。超声造影剂最初是为了增加超声显像的效果，以利于疾病的诊断。近年来研究发现超声造影剂微泡与低频超声联合应用在肿瘤治疗中具有较好潜力。超声造影剂微泡联合低频超声可提高细胞膜通透性、介导基因转染、药物输送、栓塞肿瘤滋养血管、开放组织屏障等，发挥靶向治疗作用，具有安全、靶向、无创的特点。本文对超声造影剂微泡联合低频超声在肿瘤靶向治疗中的研究进展作一综述。

1 概述

早期超声微泡造影剂为含空气或氧气的无包膜气泡，尺寸较大，不稳定，不能由外周静脉注入。上世纪90年代开始，出现了新型外围包裹白蛋白、脂类、聚合物或表面活性剂膜壳的空气微泡的壳膜造影剂，体积小，稳定性好。接着出现了膜包裹的含氟碳类气体的新型微泡造影剂，比如八氟丙烷、全氟丁烷、六氟化硫或含氟碳类气体混合物[1-3]。这类微泡造影剂与红细胞直径相似，自外周静脉快速注射进入人体后，可以顺利通过肺循环进入体循环。随着分子成像技术的快速发展，近年来涌现出一批纳米级超声造影剂，例如纳米级脂质体造影剂、纳米级氟碳乳剂及纳米级微泡造影剂，既能通过肿瘤的血管壁，又能具有很好的回声特性。超声微泡造影剂的不断革新是低频超声联合微泡治疗肿瘤的基础。

1917年Rayleigh首次提出了空化效应，该效应指超声波在液体中传播时，液体中的微小泡核（空化核）震荡、膨胀、收缩、崩溃，由此产生巨大的剪切力使处于空化核周围的组织细胞壁和质膜被击穿[4]。自Gramiak等[5]首次报道了超声回声增强现象并开始研究超声造影后，研究者陆续发现超声作用下液体中的微小气泡即空化核具有治疗潜力。超声微泡造影剂的物理特性使其成为理想的空化核，不但可明显增加空化细胞核的数量，增强低频超声的空化效应，还能极大地降低空化阈值。低频超声作用于肿瘤主要有3种机制：机械效应、热效应、空化效应。

2 抗肿瘤血管作用

实体肿瘤的发生、发展、侵袭和转移依赖肿瘤血管的生成。肿瘤血管生成是指肿瘤微血管网通过内皮细胞形成新生血管，为肿瘤细胞增殖提供充足的氧气等营养物质。目前抗肿瘤血管生成均采用化学或生物药物攻击肿瘤新生血管的特异性靶点，不良反应多，治疗效果不理想。利用静脉注射超声造影剂微泡，增强低频超声空化效应，可靶向毁损肿瘤的新生血管。微泡可降低超声空化效应阈值，增强空化效应，可损伤血管管壁，激活内源或外源性凝血，诱发大面积毛细血管栓塞，阻断肿瘤组织细胞的营养供应，导致肿瘤组织坏死[6]。空化效应所产生的休克波不仅使细胞膜通透性增加，还可使微血管破裂，内皮细胞间隙增宽，同时介导血管内皮层破坏,暴露血管内皮下层,引起血管内血栓形成，阻断恶性肿瘤组织的血供[7]。Shen等[8-9]报道超声造影剂微泡联合低频超声组兔VX2肝癌凝血坏死、间质出血和血管内血栓形成，血管内皮细胞壁破裂，内皮细胞间隙扩大，间质红细胞渗漏，微血管血栓形成，动脉弹性膜分离，局部血管壁缺损，孔洞形成，破裂区表面粗糙不规则，具有抗血管生成作用。

3 血脑屏障和血脊髓屏障开放

中枢神经系统中血脑屏障和血脊髓屏障限制了大多数治疗相关药物及分子的通过，影响中枢神经系统肿瘤治疗的疗效。开放血脑屏障和血脊髓屏障，使药物和利用受体介导的运输技术改造的分子进入中枢神经系统，已成为中枢神经系统肿瘤治疗的最前沿。Shih-Ying等[10]报道超声造影剂微泡联合低频超声可使腔中气泡膨胀和收缩，其引起的直接拉伸应力以及在血管处的剪切应力使血脑屏障和血脊髓屏障渗透性改变，增强细胞旁和跨细胞转运。Dallan等[11]报道超声造影剂微泡联合低频超声可抑制对外排转运蛋白的作用，血脑屏障转运蛋白基因表达降低，P-糖蛋白的表达可被抑制48 h以上。Lipsman等[12]报道阿尔茨海默病患者和肌萎缩性侧索硬化症患者中血脑屏障通透性增强，提高了治疗的疗效。

Charissa等[13]报道超声造影剂微泡联合低频超声可增加中枢神经系统中的药物积累，减少淀粉样茁斑块负荷。血脊髓屏障开放与血脑屏障开放类似，可以提高肿瘤治疗的疗效。Meaghan等[14]报道超声造影剂微泡联合低频超声下大鼠脑膜转移瘤模型中肿瘤控制得到了改善。

4 免疫疗法

肿瘤免疫疗法被认为是肿瘤治疗的最有希望的策略之一，因其利用患者自身的免疫系统选择性地攻击和破坏肿瘤细胞，通过增强抗肿瘤免疫应答或标记肿瘤细胞以使其对免疫系统以更可见的方式来释放免疫系统功能。原理是肿瘤表达特定的肿瘤抗原，因正常的体细胞不会表达或仅表达程度较小的抗原，故可用于引发肿瘤特异性的免疫反应。

Patricia等[15]报道低频超声联合微泡造影剂可促进肿瘤抗原直接递送到体内免疫细胞，并激活树突状细胞。Gilles等[16]报道低频超声联合微泡造影剂可导致CD8+CD4+T细胞活化。Heleen等[17]报道低频超声联合微泡造影剂可将编码肿瘤抗原和免疫调节分子的mR原NA直接递送至树突状细胞的细胞质，使树突状细胞转染。Yang等[18]报道低频超声联合微泡造影剂可使自然杀伤细胞的肿瘤浸润增强。

5 诱导肿瘤细胞死亡

细胞增殖失控和死亡抑制是肿瘤发生的主要原因，低频超声联合微泡造影剂可通过机械效应和空化效应明显抑制肿瘤细胞增殖和克隆形成，其形态学变化包括各种死亡方式，即肿瘤细胞坏死、自噬和凋亡，达到抑癌效应[19-21]。超声造影剂微泡联合低频超声可诱导肿瘤细胞死亡，抑制肿瘤细胞增殖、侵袭及转移[19，22]。低频超声联合微泡造影剂抑制肿瘤细胞增殖、侵袭及转移,可能与空化效应有关[23]。文献报道超声造影剂微泡联合低频超声可促进前列腺癌细胞、肝癌细胞、卵巢癌细胞、胶质瘤细胞及人白血病细胞等肿瘤细胞的死亡[24-26]，又可减少对正常组织的损伤。Hou等[27]报道超声造影剂微泡联合低频超声可影响肿瘤的低氧反应，抑制肿瘤生长，促进细胞凋亡。Shen等[28]报道增加胶质母细胞瘤裸小鼠和裸鼠移植瘤血-肿瘤屏障PTX紫杉醇-脂渗透血脑屏障，提高对胶质母细胞瘤化疗效能，免疫组化证实诱导细胞凋亡和抑制增殖。Zhang等[29]报道超声造影剂微泡联合低频超声可显著抑制小鼠前列腺癌细胞表面抗原标志物CD11c和成熟标志物CD83的表达，抑制肿瘤细胞增殖。Ji等[30]报道外源性miRNA-133A处理MCF-7和MDA-MB-231细胞时，miR133a表达明显上调，转染后明显抑制表皮生长因子受体表达和Akt磷酸化，抑制乳腺癌小鼠细胞肿瘤增殖，提高其存活率。Yang等[31]报道低频超声联合微泡造影剂作用组在抑制肿瘤生长、促进细胞凋亡、抑制细胞增殖和血管生成方面更有效。Wu等[32]报道超声造影剂微泡联合低频超声使SMMC-7721人肝癌细胞凋亡增加，而迁移和侵袭能力明显降低。

6 基因靶向治疗

低频超声使微泡瞬间击碎，空化效应产生的休克波使得局部毛细血管和临近组织细胞膜的通透性增高，细胞外的大分子即可进入细胞，使DNA的基因转染和表达明显升高[33]。超声造影剂微泡联合低频超声介导的靶向基因治疗不会引起机体的免疫反应和病毒载体产生的突变，是一种新型安全高效的基因转染技术[34]。Wu等[32]报道低频超声联合微泡可提高SMMC-7721人肝癌细胞siRNA的转染效率，使转染效率明显提高，增强基因转染。Zhao等[35]报道超声造影剂微泡联合低频超声提高了MCF-7中siRNA的转染效率和卟啉的摄取，更有效地抑制ER+乳腺癌，显示出良好的协同作用。Delalande等[36]报道超声造影剂微泡联合低频超声可有效地传递质粒DNA、mRNA或siRNA。

微泡与基因结合的方式有两种：一种是将微泡与裸基因或基因载体直接混合；另一种是将基因包裹在微泡的内部或与微泡外壳结合。微泡制备为基因载体后,既可经外周血管注入体内,又可在超声引导下将基因与微泡载体直接注入靶区,用超声辐照靶区破坏微泡,使内部及表面结合的基因释放出来。

7 药物输送

化疗是目前临床治疗肿瘤的重要方法之一，其利用被封装在载体中的化疗药物消除快速分裂的肿瘤细胞。近年来研究发现携带药物的超声造影剂微泡联合低频超声治疗能够局部改变肿瘤环境，改善血管通透性，增加肿瘤细胞内化疗药物浓度，增加化疗药物治疗效果，抵抗肿瘤细胞耐药性，改善药物向肿瘤的输送，即具有化疗增敏效应[37-38]。将携带化疗药物的微泡造影剂静脉注射入人体内，用低频超声辐照特定组织，使微泡破裂，辐照局部毛细血管破裂，微泡所携带的药物由此通过内皮细胞屏障释放到靶区。同时低频超声导致细胞膜产生一过性空隙，通透性增加，即声孔效应，药物分子得以进入细胞内，引起肿瘤细胞内药物水平增加,增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，提高疗效[39-40]。Xiao等[41]报道超声造影剂微泡联合低频超声可通过降低组织间质压力来增强化疗药物进入肿瘤间质，以提高肿瘤治疗的疗效。Mariglia等[42]报道应用低频超声联合微泡可增强核苷类似物吉西他滨的胰腺癌细胞毒性，提高胰腺癌化疗效果，延长生存期。Zhao等[35]报道低频超声联合多功能FOXA1载卟啉微泡通过超声诱导声穿孔效应显著增加卟啉和siRNA的局部积累，对雌激素依赖性ER+乳腺癌具有良好的治疗效果。Li等[43]报道氟尿嘧啶（5-FU）聚乳酸纳米微泡受低频超声辐照可以进一步提高药物的靶向性，有效抑制裸鼠肝细胞肝癌的生长。

利用超声造影剂微泡联合低频超声治疗肿瘤仍处于实验阶段，有较多问题亟待解决。首先，微泡造影剂的破坏受多种因素的影响,文献报道中所采用的超声波参数（如超声波工作频率、声强、超声辐照时间与方法）并不完全一致。因此需研究对不同疾病的应用价值，并针对各种应用进行参数优化。其次，加强微泡与配体的结合力以及配体与受体之间的结合强度，增加靶向性，以及有效地控制释放时机等是我们需要解决的重要问题。最后还需进一步提高超声造影剂微泡联合低频超声治疗的安全性，减少溶血、微血管渗漏及毛细血管破裂等。总之,超声造影剂微泡联合低频超声治疗肿瘤是一项具有广阔应用前景的治疗方法，具有安全、高效、靶向性好、可控性强等优点，是超声医学研究热点之一。随着超声分子影像学和靶向微泡造影剂的发展，低频超声联合微泡造影剂治疗肿瘤将在基础及临床研究中得到广泛的运用，为临床肿瘤的治疗带来新的希望。