tRFs生物学功能以及在癌症研究中的新进展

赵 敏，丛 珊，田 畅，刘伽莹，周佳琪，苑静怡，李 倩，王 珂

(吉林大学第二医院 呼吸与危重症医学科，吉林 长春130041)

近年来随着对非编码RNA(noncoding RNAs，ncRNAs)研究的深入，发现非编码RNA，比如miRNAs、piRNAs以及circRNAs，在各类疾病发生、进展以及治疗等方面都有重要作用[1]。最近，一类来源于tRNA的小的非编码RNA逐渐引起广泛关注[2]。在真核细胞的细胞核中，tRNA被RNA聚合酶Ⅲ转录，转录在tRNA成熟序列3′端下游10-60 nt处延伸了四个或多个Ts后终止[3]。前tRNA和成熟tRNA在输出到细胞质过程中经历了广泛的修饰，从而产生了2种tRNA来源的小RNA(tRNA-derived small RNAs ，tsRNAs)：(1)tRNA的一半(tRNA halves，tRHs)(2)tRNA衍生片段(tRFs或者tDRs)[4]。大多数tRNA halves由应激激活的血管生成素(Angiogenin，ANG)介导tRNA裂解所产生，故tRNA halves也被称作 tRNA衍生的应激诱导RNA(tRNA-derived stress-induced RNAs，tiRNA)[5]。实验研究证明，tRFs参与转录后调控，同时tRFs可能是某些疾病的治疗靶点[6]。

随着第二代基因测序技术的发展，越来越多的实验研究可以提供给我们更多关于非编码RNA信息，这其中包括tRFs，在这篇综述中我们着重描述tRF的生物特性以及其在癌症中的作用。

1 tRFs生物学功能

在早期研究中，部分tRFs经常被认为是miRNAs，实验研究得出，在应激条件下人体可以新合成一些tRF和miRNA，其中miR-1280，miR-1274a/b和miR-886-5的序列分别与tRNALeu的3′末端，tRNALys的3′-端和tRNAAla的5′-端一致，后期研究表明，miR-1280实际上来源于tRNALeu。使用生物信息学分析，miR-1274-a/b与tRNALys3′末端/tRNALys5′末端之间存在明显的正相关，表明这两个miRNA本质上是tRF[7，8]。尽管大多数tRF的详细机制仍不清楚，但以上研究已证实，某些tRF可以抑制靶基因的翻译并调节靶基因的表达，类似于miRNA。但是，最近的一项研究表明，某些tRF3以不依赖于Dicer酶而与Argonaute蛋白质直接结合的方式发挥其抑制作用[9]。

1.1 调控靶基因表达

tRFs与基因表达调控和基因沉默有关。Yeung[10]等人发现人类免疫缺陷病毒(HIV)中某个长度为18nt的tRF丰度很高。实验证明，此18nt的tRF 来源于tRNALys。HIV RNA与人tRNALys的3′末端形成了双链RNA杂交体，使用病毒逆转录酶将其逆转录为cDNA后发现由tRNALys产生的3′-tRF与AGO2和Dicer的结合促进细胞抑制HIV逆转录作用，进一步证明了哺乳动物细胞可以利用RNAi防御外源性逆转录病毒的感染[10]。 Sharma[11]等人发现精子中存在的tRF抑制了胚胎干(ES)细胞和胚胎中与内源性逆转录相关基因的表达。从功能上讲，在ES细胞和胚胎中，从tRNAGly-GCC产生的tRF-5都抑制了与内源性逆转录因子相关的基因表达。

研究发现在人单核细胞中，PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNA，piRNA)，tRNAGlu衍生的piRNA[tRNAGlu-derived piRNA,td-piR(Glu)]的表达要比树突状细胞丰富得多[12]。RNA聚合酶III调节tRNAGlu和随后的td-piR(Glu)的生物发生。在与piRNA相互作用后，td-piR(Glu)/ PIWIL4复合物募集了SET结构分支1(SET domain bifurcated 1，SETDB1)、杂色抑制物3-9同源物1(suppressor of variegation 3-9 homolog 1 ，SUV39H1)和杂染色质蛋白1β到CD1a分子(CD1a molecule，CD1A)启动子区域，并且促进了H3K9甲基化，从而显着抑制CD1A转录[12]。

1.2 调节翻译

实验研究发现，多种小的非编码RNA(small non-coding RNAs,sncRNAs)具有调节翻译功能，包括tRFs和tiRNA[13]。Yamasaki[10]等人将天然存在的5′-tiRNA转染到人成骨细胞系U2OS中，发现细胞系翻译受到抑制。而在体外进行的实验进一步表明，5′-tiRNA的5′端有四个或更多的末端寡鸟嘌呤基序(terminal oligoguanine motifs，TOGs)是抑制翻译的关键序列。由于该RNA序列包含在5′-tRF中，因此tRFGln也能够抑制翻译。Sobala和Hutvagner发现翻译抑制作用仅限于5′-tRF序列，进一步研究发现，实验涉及的所有5′-tRFs都包含序列“GG”，而该序列对于翻译抑制是必需的，所有的“GG”序列位置根据亲本tRNA不同而不同，但都位于5′-tRFs 的17-18或18-19位[5]。

1.3 调节细胞应激反应

研究表明，tiRNA在应激状态下表达增加，尤其是在饥饿和氧化条件下[14]。在哺乳动物细胞中，ANG作为一种分泌的核糖核酸酶，可以抑制蛋白质合成，并促进砷和多胺诱导的应激颗粒(stress granules，SGs??)生成，同时也可剪切tRNA形成tiRNA来启动应激反应。SGs与细胞凋亡，病毒感染，免疫反应以及蛋白质折叠和转移有关。 Emara[15]等人发现tiRNA的转染诱导了SGs的磷酸化-真核翻译起始因子2α独立装配。SGs的形成可以暂时沉默mRNA，从而影响转录，故可以帮助细胞在应激情况下存活[16]。在小鼠胚胎成纤维细胞中，线粒体中细胞色素c(Cyt-c)的释放致细胞渗透压发生变化，ANG剪切的tiRNA竞争性地与Cyt c结合，以保护细胞免受渗透压急剧变化导致的细胞凋亡。用ANG处理细胞可抑制应激诱导的凋亡小体形成，并增加sRNAs与核糖核蛋白(Cyt c-RNP)复合物中释放的Cyt c的相互作用。这意味着tRF在防止细胞凋亡中起重要作用[17]。

2 tRFs与癌症

近年来，tRFs调节人类疾病的机制，例如癌症，病毒感染，病理性应激损伤，代谢性疾病和神经系统疾病引起了广泛关注。这其中与癌症相关的tRFs研究内容更加广泛。我们已经研究了大肠癌、乳腺癌、B细胞淋巴瘤、前列腺癌、肝细胞癌、肺癌等癌症相关的tRFs。但是对tRF介导的癌症进展的了解仍处于起步阶段。在各种不同的细胞阶段，诸如分化，增殖，分裂，衰老和凋亡，RNA聚合酶装配的分子破坏，染色质重塑，转录因子结合，RNA编辑，RNA剪接和核糖体扫描等不同的细胞阶段，tRF都有可能导致癌症[18，19]。

2.1 影响癌症发生

Yang[20]等人发现NSCLC肿瘤组织中的tRF-Leu-CAG 水平高于正常组织，并且在NSCLC细胞系中也上调。进一步实验研究发现，当人为控制tRF-Leu-CAG的表达量降低时，Aurora激酶A (Aurora kinase A，AURKA)的表达也被抑制，而AURKA为致癌基因。研究证实，miR-137和miR-32可以直接靶向AURKA并影响NSCLC的进展[21]。但具体基因AURUK是否为tRF-Leu-CAG的直接靶标，而tRF-Leu-CAG能否与miR-137或miR-32相互作用，目前尚无定论。在关于CLL实验中，研究人员发现ts-101和ts-53在17p-CLL中缺失，而ts-53以miRNA方式靶向TCL1[22]。同时发现ts-46和ts-47在CLL和肺癌中被下调，表明ts-53，ts-46和ts-47的特异表达可抑制细胞集落形成，该实验可以证明tRF可被视为肿瘤抑制器，从而干扰基因的表观遗传调控[2]。

2.2 影响癌症增殖、转移

在大肠癌(colorectal cancer，CRC)中，Huang B[23]等人发现，来源于tRFLeu和pre-miRNA衍生的17nt片段的tRF/miR-1280通过抑制Notch信号通路抑制了CRC的生长和转移。作为tRF/miR-1280的直接靶标，Notch配体锯齿2(JAG2)减少了肿瘤的形成和转移。进一步研究发现，tRF/miR-1280介导的Notch信号传导失活通过直接抑制基因Gata1/3和miR-200b的转录来抑制癌症干细胞(CSC)表型。

通过与RNA结合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)结合，一些tRFs可能起着肿瘤抑制因子的作用[24]。Y盒结合蛋白1(Y box binding protein 1，YBX1)是一种多功能的RNA结合蛋白，已经参与了许多关键的细胞途径，并在各种癌症类型中高度表达。一类来自tRNAGlu，tRNAAsp，tRNAGly和tRNATyr的新型tRF，通过从RNA结合蛋白YBX1置换其3′-UTRs来抑制乳腺癌中多种致癌转录物的稳定性[16]。另外，在B细胞淋巴瘤细胞中，tRF-3027通过抑制复制蛋白A1(RPA1)(一种内源性单链DNA结合蛋白)来抑制细胞增殖并调节DNA损伤[25]。

近年来，ANG诱导的tRF在癌症中的调控引起了更多关注。 ANG诱导的tRFs诱导应激颗粒的重新翻译和组装，提示tRFs对ANG介导的细胞增殖和血管生成具有直接作用[26]。其他研究表明，tRFs通过与Cyt c结合抑制细胞凋亡[5]。

2.3 与耐药性相关

Cui[27]等人的研究发现，tDR-0009(源自tRNAGly-GCC-1-1)可能与三阴性乳腺癌(triplenegative breast cancer，TNBC)的化学耐药性(对阿霉素的抗性)有关。Sun[28]等人还报道了tRF-30-JZOYJE22RR33和tRF-27-ZDXPHO53KSN在乳腺癌的曲妥珠单抗耐药中具有重要作用。最近一项实验研究可以说明，tRF-Leu-CAG可能引起NSCLC的化学耐药性并诱导自噬。

2.4 作为诊断标志物

源自前体tRNASer的tRF-1001在许多癌细胞系中高度表达。tRF-1001的敲除导致DNA生物合成和细胞增殖的抑制[29]。通过检测前列腺癌样品中不同阶段tRF的组成和表达，Olvedy等人发现598个差异表达的tRF[30]。其中大多数上调的tRF是从tRF-5产生的，而下调的tRF是从tRF-3产生的。该证据表明，tRF可用作前列腺癌的潜在生物标志物。Yang等人发现不仅可以在NSCLC细胞系中检测到tRF-Leu-CAG表达水平上调，NSCLC肿瘤组织和血清中也可以检测到tRF-Leu-CAG的表达水平高于正常组织。这表明NSCLC血清中的tRFLeu-CAG可被视为诊断生物标志物。

总之，随着各项研究深入，我们发现tRFs与肿瘤的发生、发展、诊断以及治疗等方面关系密切，但是一方面研究发现在癌症发生阶段tRFs较正常组织表达含量有所增加，似乎tRFs可以被当作致癌因子，但另一方面，在肿瘤进展期时，当敲除tRFs基因时，可以加速肿瘤的进展以及转移，从这一方面来看，tRFs可以被看作抑癌因子。造成上述结果可能的原因是在癌症发生初期致癌物质或者体内环境变化致细胞应激，导致tRFs在细胞、组织以及血清中检测到表达水平升高，而在后期肿瘤发展阶段，tRFs本身以抑癌因子身份出现，可以抑制肿瘤转移。从抑制肿瘤转移这一点来看，tRF的生物学机制与miRNA的生物学机制非常相似[16]。但上述结果仍需要进一步实验加以论证。

3 结论与展望

综上所述，tRFs存在干扰作用，且与miRNA或lncRNAs作用机制相似。同时在应对氧化应激等细胞环境变化的情况，tRFs也能相应的做出调控反应，使细胞免受伤害或降低伤害造成的后果。随着转录组学高通量技术与第二代基因测序技术的发展，我们发现一些曾经被认为是其他sncRNA，其实是从tRNA生成的，并被重新定义为tsRNA。比如说，MiR-4521和miR-3676可以与tRNA序列结合，称为ts-4521和ts-3676，MiR-1280也可以从tRNALeu生成，这些tsRNA已被证明与Piwi蛋白相互作用，并在癌症中发挥作用。

总之，尽管tRFs需要进行更多的研究，但根据最近发表的论文，我们可以了解到不管在细胞生命还是肿瘤发生过程中，tRFs起关键作用。尤其在与肿瘤相关的研究中我们可以看到，tRFs不仅可以在肿瘤的发生发展中起重要作用，而且能够作为癌症诊断的新的潜在生物标志物，同时也有可能成为今后癌症治疗的新靶点。