非编码RNA：支架内再狭窄治疗策略的新靶点

杨双亚 综述 邓文文，石蓓 审校遵义医科大学附属医院心血管内科，贵州 遵义 563000

冠心病严重危害人类的健康，是全球范围内致死和致残的主要原因之一。经皮冠状动脉介入治疗是临床上冠心病最常见的治疗方法。但同时，也带来了一系列的问题，比如血管损伤、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)过度增殖以及新生内膜形成。导致术后血管愈合延迟、管腔狭窄及支架内再狭窄(in-stent restenosis，ISR)，最终引起术后患者死亡率增加[1-2]。ISR 在时间上可分为两个阶段：早期阶段和后期阶段。在早期(几天到几周)阶段，植入支架会引起动脉壁机械损伤、内皮破裂和功能障碍。随后导致血栓形成、纤维蛋白和血小板聚集及炎症反应。在晚期(几周到几个月)阶段，VSMC高度分化，发生表型转化，细胞增殖和迁移能力增强，导致新生内膜增生和ISR[3]。

目前临床上应用最多的是植入裸金属支架(bare metal stent，BMS)和药物洗脱支架(drug eluting stents，DES)。研究表明，BMS 可以防止血管弹性回缩，可用于治疗由动脉粥样硬化斑块引起的狭窄，但同时它也诱导VSMC 过度增殖，导致新内膜增生和再狭窄。DES是一种聚合物支架，不仅可以将药物输送到局部特定的受损区域，还避免了全身毒性。与BMS 相比，携带抗增殖药物涂层的DES 虽然可以显著降低ISR，但同时它也抑制了受损血管愈合，导致愈合延迟，引起晚期支架内血栓形成发生率上升[4]。

大量研究表明，非编码RNA (noncoding RNA，ncRNA)广泛参与激活或调节细胞增殖、凋亡、分化、代谢和免疫反应。在支架内再狭窄过程中，ncRNA表达失调，而特定的ncRNA 靶向作用于受损血管区域，通过抑制平滑肌细胞增殖和新生内膜形成，可以减少支架植入造成的血管损伤。本综述主要讨论在支架内再狭窄过程中，ncRNA 对VSMC 增殖和迁移及EC 功能的调控作用。

1 非编码RNA和再狭窄

非编码RNA(Non-coding RNA)是指不编码蛋白质的RNA。按照非编码RNA 片段的长度，可将它们分为两大类，即短非编码RNA 和长非编码RNA。短非编码RNA 包括microRNAs、小干扰RNA(siRNA)、小核RNA(snRNA)、piwi 相互作用RNA(piRNA)和转移RNA (tRNA)。长非编码RNA 包括核糖体RNA(rRNA)、天然反义转录本和长链非编码RNA (lncRNA)等。

1.1 MicroRNA 和再狭窄 微小RNA(miRNA)是长度为18~25个核苷酸的非编码单链小RNA分子。能够识别特定的靶基因mRNA，并在转录后水平负调控基因表达。miRNA广泛参与细胞增殖、分化、迁移、肿瘤发生发展以及炎症及免疫应答等。microRNA在调节心脏及血管功能中起重要作用，同时，miRNA 也在调节EC和VSMC的细胞通讯中起到重要作用。

1.1.1 miRNA 调节VSMC 功能 PCI 术后再狭窄主要的病理变化是VSMC 的增殖、迁移和分化。VSMC 从收缩表型转换为合成表型，迁移至内膜，导致内膜增生和血管狭窄[5]。许多miRNA 在调节VSMC 功能中起着至关重要的作用。在血管重塑及新生内膜形成过程中，VSMC收缩表型会转化为合成表型。miRNA-143/-145在VSMC中高表达，可通过沉默转录因子Elk4和Klf4抑制VSMCs迁移，促进VSMCs分化，维持VSMC的收缩表型[6]。此外，miR-145还可以通过直接抑制转录因子KLF5，抑制血管损伤后VSMCs增殖和新生内膜形成[7]。当VSMCs从收缩表型转化为合成表型时，VSMCs收缩表型的标志物平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin，ACTA2)和肌球蛋白重链(myosin heavy chain，MYH11)表达减少[8-9]。上调VSMCs 中的miR-125a-5p 后，VSMCs 收缩表型的标志物ACTA2、MYH11 表达增多[10]。除此之外，miR-125a-5p 可以抑制E26原癌基因1(E26 oncogene homologue 1，ETS-1)的表达。EST-1 是VSMC 增殖和迁移的标志物，可以促进血小板衍生生长因子(plateletderived growth factor，PDGF)介导的VSMC 表型转换。在受损血管中，miR-125a-5p表达下调，EST-1表达上调，VSMC从收缩表型转化为合成表型[11]。MiR-23b也可以调节VSMCs的表型转换。血管损伤后，MiR-23b表达下调[12]。其作用机制是通过直接靶向尿激酶(urokinase-type plasminogen activator，uPA)、Smad 3 (Smad family member 3，SMAD3)和FOXO4 (forkhead box O4，FOXO4)，促进VSMC 标志物ACTA2 和MYH11 蛋白的表达[13-14]，从而抑制血管平滑肌细胞增殖和内膜增生。同时，还有许多miRNA 可以通过靶向信号传导通路调节VSMC 的功能与表型转化。如miR-663 的表达上调后，促进VSMC 分化，抑制PDGF 诱导的VSMC 的增殖和迁移[15]。miR-195前体则通过抑制细胞周期调节因子Cdc42，减轻炎症反应及细胞增殖[16]。除此之外，miR-125b、miR-130a、miR-146a 和miR-210 也被报道可调节VSMC功能[17]。送检ISR患者的血液进行基因测序后发现，miR-100、miR-143 和miR-145 水平表达下调，而miR-21显著上调。综上，miRNA可靶向作用于与VSMC 功能相关的不同分子及通路。miRNA 在支架内再狭窄的靶向治疗及作为早期标志物方面具有巨大前景。

1.1.2 miRNA 调节内皮细胞功能 在支架内再狭窄、局部再缺血和晚期血栓形成过程中，内皮细胞从静止状态转化为激活状态[18-19]。目前，内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)已被广泛用于各种支架涂层中，提高损伤后血管的愈合能力，且在临床实验中取得一定成效[20]。内皮细胞对破裂区域的不完全覆盖是晚期血栓形成的主要原因之一[18]。因此如何尽早地实现再内皮化成为一大热点及难点。目前研究发现一些miRNA 可改善内皮细胞功能，这些miRNA 被认为是支架内血栓形成潜在的治疗靶点[21]。MiR-126 由内皮细胞表皮生长因子样结构域7(EC-specific gene epidermal growth factor-like domain 7，Egfl7)编码，其在动脉粥样硬化斑块中表达上调，参与血管的形成。MiR-126 通过抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通路中的负调节因子，促使内皮细胞增殖和迁移[22-23]。miR-17-92通过调节TGF-β/Smad3和BMP/BMPR2信号通路，促进VSMC 增殖及再内皮化。miR-92a 表达上调后，使抗动脉粥样硬化Krtippel 转录因子2 (anti-atherosclerotic Krtippel transcription factor 2，KLF2)表达下调。同时，miR-92a 可以下调内皮细胞中一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表达，从而加速支架植入后的内皮再生[24-25]。研究表明miR-221 和miR-222 促进血管平滑肌细胞增殖、血管内膜新生和再狭窄。同时可抑制内皮细胞的增殖、迁移及存活。学者们认为miR-221/222 在VSMC 和EC中的不同效应可能有利于支架术后血栓形成和再狭窄的治疗[26-27]。

1.2 LncRNA 和再狭窄 长非编码RNA (LncRNA)是长度超过200 nt 的非编码RNA，人类基因组中存在超过10 000 个lncRNA。最初，lncRNA 被认为是无用的RNA。最近有证据表明，lncRNAs在许多生理学和生理学中起着关键作用病理过程，包括细胞增殖、凋亡、迁移、炎症和心血管疾病[28]。

1.2.1 LncRNA调节VSMC功能 血管中富含的lncRNA SENCR通过调控收缩蛋白调节血管平滑肌细胞的分化和迁移[29]。敲除lncRNA SENCR 后，血管新生相关因子midkin 上调，促进VSMCs 发生早期表型转化。同时，lncRNA SENCR还可以促进ECs增殖、迁移和血管生成。LncRNA-H19在动脉粥样硬化后新生内膜中高表达。磷酸酯酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)可抑制促炎细胞因子表达减少内膜增生[30]。研究表明，LncRNA-H19靶向抑制PTEN 调控miR-675 促进血管平滑肌细胞增殖[31]。SMILR是一种血管平滑肌细胞中特有的lncRNA，通过特异性靶向透明质酸合酶2(HAS2)促进VSMCs增殖[32]。血小板来源生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)和白介素处理的VSMCs中SMILR表达上调促进VSMC 增殖。内皮细胞血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)诱导VSMCs中miR-221和miR-222表达上调，促进VSMC 增殖、迁移及炎症反应[33]。Lnc-Ang362是这两种促进VSMC增殖的miRNA的宿主基因，可以促进VSMCs增殖及新生内膜形成。染色体9p21是疾病相关基因多态性的重要区域，它与全基因组关联分析(genome wide association studies，GWAS)心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)息息相关[34-35]。LncRNAANRIL是编码染色体9p21区域的长链非编码RNA，是冠状动脉疾病的易感遗传位点[36]。研究表明，LncRNAANRIL在VSMCs和ECs中均高表达，通过介导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDKN2A/B 促进VSMCs 增殖和表型转化[37-38]，调控内皮细胞功能[39]。因此，这项研究表明，上调ANRIL 的表达可能会降低再狭窄率。

1.2.2 LncRNA调节EC功能 P53是调控细胞凋亡的重要因子，研究表明lncRNA-p21是P53的靶基因，lncRNA-p21 与E3 泛素蛋白连接酶小鼠双分2 蛋白(mouse double minute 2，MDM2)直接结合后，促进p53与P300结合，进而增强p53转录活性，抑制EC增殖[40]。此外，在ECs中，LincRNA-p21还可以通过海绵样吸附miR-130b 后诱导细胞凋亡，抑制细胞周期[41]。LncRNA MALAT1 在内皮细胞中高表达，与内皮细胞功能、炎症反应和血管生成相关。在人内皮细胞系(HUVEC)中，FOXM1是调控真核细胞周期的转录因子，而MALAT1 通过抑制FOXM1表达，同时与miR-320a相互作用，最终抑制细胞增殖[42-43]。炎症反应引起的内皮损伤是支架再狭窄发生发展不可或缺的关键环节。LncRNA ENST00000509256 调控细胞信号传导和神经活性配体受体[5]，因此，ENST00000509256可能在内皮激活后参与炎症反应。研究表明，lncRNA punisher能影响内皮细胞增殖和血管再生，但是目前具体机制仍不清楚[44]。

1.3 其他ncRNAs

1.3.1 小干扰RNA 小干扰RNA(siRNA)是长度20~25 个核苷酸的双链RNA，通过与mRNA 的结合，抑制特定mRNA的翻译及蛋白表达。尽管哺乳动物中siRNA 含量少，但是通过各种转染技术，它们可以特定、有针对性地去沉默基因。因此，siRNA是研究基因的重要工具和药物靶标。最新研究表明，它也是再狭窄的治疗策略之一。整合素在细胞黏附和迁移中起着至关重要的作用，而Kindlin-2是参与整合素聚集和激活的关键成分[45]。因此，通过调节整联蛋白，可以抑制VSMC活化和迁移[46]。使用siRNA特异性抑制Kindlin-2 后，有效地阻断了Wnt 信号传导，从而抑制VSMC 的增殖和迁移[47]。基质相互作用分子1(STIM1)有助于生长因子诱导的VSMC增殖，然而，在使用siRNA抑制STIM1后，人心脏血管平滑肌增殖能力下降。此外，特异性抑制STIM1 的小干扰RNA 还可以抑制颈动脉血管成形术动物模型的再狭窄[48]。ZHANG 等[49]通过植入si TGF-β1基因支架后，有效地减少了兔髂动脉内膜损伤后内膜增生，显著降低支架植入后的再狭窄率。这说明，siRNA 在支架植入术后具有预防再狭窄的潜在治疗效果。

1.3.2 环状RNA 环状RNA(cirRNA)富含miRNA结合位点，可海绵样吸附miRNA并抑制其表达，促进靶基因mRNA 的翻译[50]。circRNA 可作为诊断标志物并参与心血管疾病的发生发展，例如circ-0083357、circ-0082824、circ-0068942、circ-0057576、circ-0054537、circ-0051172、circ-0032970 和circ-0006323 通过促进TRPM3 表达，抑制冠状动脉疾病患者的hsa-mir-130a-3p 表达[51]。内皮细胞中高表达的cirRNA CZNF609[52]，海绵样吸附miR-615-5p 后抑制其活性，当沉默cZNF609 后，可促进内皮细胞迁移，保护内皮细胞免受氧化应激[53]。此外，cirRNA-HRCR，作为一种内源性miR-223海绵，能够调节心力衰竭[54]。

1.3.3 piRNA Piwi相互作用RNA(piRNA)是长度约30 nt 的小RNA，主要存在于哺乳动物的生殖细胞和干细胞中，通过与Piwi亚家族蛋白结合形成piRNA复合物(piRC)来调节基因沉默途径[55]。然而，关于piRNA的研究仍处于初步阶段，很少有报道其在动脉粥样硬化和再狭窄中的作用。

2 小结

冠状动脉支架植入是目前治疗冠心病最主要的方法。然而，冠心病患者支架植入后20%~30%发生再狭窄。药物洗脱球囊及生物可吸收支架里程碑式的出现，将再狭窄率降低到10%以内，但其仍然存在着愈合延迟、迟发性支架内血栓形成等缺点。基于此，需要一个更为完善的治疗策略以预防支架内狭窄。基因支架是近几年支架技术的一大突破，它可以减轻支架植入后相关的血管问题。基因支架不仅含有抗炎和抗血栓药物，同时携带miRNA 和siRNA 等ncRNA。通过使用涂有ncRNA的支架，可以调控血管易狭窄区域基因的表达，预防晚期血栓形成。目前，ncRNA支架仍处于探索阶段，对于其在心血管疾病中发挥作用的理解仍然有限。在ncRNA 支架应用于临床前，必须弄清楚这几个问题，例如，非编码RNA是如何发挥他们的作用的？它们是否会对附近的基因产生负面影响？因此，尽管大量的动物模型以及一期临床试验已经表明了其作为治疗冠心病支架内再狭窄的优越性及有效性，但距离真正应用于临床，仍然还有很长的路要走。