表面等离子共振技术研究进展及应用

王永智 叶华跃 聂利芳 吴宏斌 邱文娜 方朝东 雷高新 曾玮乔

1.泰州医药高新技术产业园区疫苗工程中心，江苏泰州225300；2.江苏华泰疫苗工程技术研究有限公司，江苏泰州 225300；3.江苏大同盟制药有限公司，江苏泰州225300

1 表面等离子共振技术的发展历史及研究进展

1902年R.W.Wood[1]在一次光学实验中观察并记录了金属光栅的异常衍射现象，他称之为“Wood异常”，这是人们首次记录的表面等离子共振（surface plasmon renounce，SPR）现象。1941年U.Fano依据金属和空气界面上表面电磁波的激发原理首次成功解释了SPR现象[2]。Kretschmann于1971年提出Kretschmann结构为SPR生物传感器奠定了基础，同时也促成了SPR技术在实验中的应用[3]。1983年，Liedberg等首次利用SPR进行IgG与其抗原的反应测定并取得了成功。1987年，Knoll等开始进行SPR成像研究，1990年，Biacore AB公司推出了首台商用SPR仪器，使SPR技术的应用研究得到了更快速的发展[4]。

SPR的原理为当一束单色偏振光透过玻璃照射到镀在玻璃表面的金或银薄膜时，自由电子在金属和玻璃介质表面积聚，产生表面极化电荷。表面电荷的集体震荡便产生了表面等离子体波（surface plasmon wave，SPW）。产生表面等必须将入射光与表面等离子波通过耦合器件进行耦合，使二者发生共振，当表面等离子波当入射光的波向量与SPW的振荡频率相匹配时[5]，便产生了SPR现象。常用的耦合器件主要有棱镜型[6]、光栅型[7]、光纤型[8-9]、光波导型[10]等，其中商品化的SPR仪器主要采用的是Kretschmann棱镜结构[10]。SPR发生后，SPW吸收了入射光的能量，反射光的能量则急剧下降以致完全消失，此时入射光的角度被称作SPR角（共振角）。SPR角随金属薄膜附近介质折射率变化而改变化，介质折射率变化情况一般又会受到待测溶液中的物质浓度的变化情况影响。因此通过测量SPR角的变化情况便可以反应待测溶液中的一些产生反应的情况[11-13]。

SPR技术主要的特点有[14-17]：（1）免标记检测。SPR 技术不需要标记样品或者对样品进行衍生化处理便可以检测。这样不仅保持了被检测分子的性质和状态，而且避免了标记过程对检测结果的不利影响。同时方便了样品处理，简化了检测流程。（2）实时动态分析。SPR技术可以实时动态监测分子相互作用的全过程，得到反应速率及动力学方程。（3）非破坏性检测。SPR技术检测过程不会对样品造成任何化学或物理破坏。（4）高选择、高灵敏性。利用生物识别、化学及物理识别等各种高特异性识别作用，需要样品数量少。（5）应用范围广。应用SPR技术检测分析的对象非常广泛，既可以研究分子质量很小的物质（如金属离子、气体分子），又可以研究相对分子质量达数十万的生物大分子（如蛋白质）甚至细胞及病毒。

2 SPR技术的应用

2.1 SPR技术在分子生物学检测领域的应用

生物分子发挥功能与其结构密切相关，生物分子结构的维持取决于生物分子内部集团之间或者分子之间的各种相互作用力。生物分子之间特异地、可逆地识别及结合等相互作用是生命活动的基础。研究分子间的相互作用是生化领域的一个核心问题，它有助于阐明生物反应的机制，揭示生命现象的本质[13]。SPR技术目前已成为分子生物学领域研究的热门工具，被广泛应用于蛋白质、核酸及多糖等生物大分子之间的相互作用研究。

Margulies等[18]利用SPR技术分析了主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）与 抗 原 递 呈 细 胞（antigen presenting cell，APC）递呈的抗原（Ag）之间的相互作用、T细胞受体（T cell receptor，TCR）与MHC/Ag之间的相互作用以及TCR与Ag之间相互作用的动力学常数。通过研究发现，TCR与MHC/Ag之间的相互作用具有亲和力低、半衰期短的特点，表明通过短暂及低亲和力的相互作用即可激活T淋巴细胞。

崔大付等[19]利用SPR技术建立了检测6-氧甲基鸟嘌吟-DNA甲基转移酶（O-6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）的方法。MGMT是一种重要的DNA损伤修复酶，与DNA烷基化损伤修复密切相关[20]，对多种肿瘤具有重要的临床意义[21-26]，MGMT的检测可以为抗肿瘤药物的开发、肿瘤的预防及治疗方案提供依据。其建立的GMGT检测方法检测线可低至1.18×10-10mol/L，为进一步推广使用及临床检测的研究打下了基础。

李雪玲等[27]利用SPR技术研究比较了抗酪氨酸磷酸化抗体与来源于胰岛素样生长因子Ⅰ受体（insulin-like growth factor 1，IGF-1R）的未磷酸化多肽序列及经过含有相应蛋白激酶的细胞裂解液处理后的多肽序列的相互作用差异。结果表明，抗酪氨酸磷酸化抗体与经细胞裂解液在不同处理条件下（孵育时间不同、细胞裂解液成分不同）处理后的多肽序列相互之间作用存在明显差异，可灵敏地区分出多肽酪氨酸磷酸化水平差异。胰岛素样生长因子Ⅰ受体（IGF-1R）信号转导通路与生物体细胞增殖、分化及抑制细胞凋亡等多种生理活动密切相关，其建立的研究方法为受体磷酸化信号通路的研究提供了一种全新的手段。

2.2 SPR技术在环境污染检测领域的应用

随着人类社会生产经济的快速发展，物质和文明水平的不断提高，环境污染问题也日趋严重。如何对环境污染物进行快速、准确的检测分析也越来越受到人们的重视[28]。选择及开发适宜的环境污染物检测技术，有助于提高检测结果的准确性及科学性，甚至关系到环境污染评价及环境治理措施的制定[29-30]。SPR技术的出现及快速发展，因其具有检测特异性强、灵敏度高及检测快速等优点，为环境污染物检测提供了一种全新的方法，并逐步在环境污染检测中得到越来越广泛的应用。

铜是动植物生长必需的微量元素，通常以化合物的形式存在于环境之中[31]。环境中过量的铜则会导致铜在生物体内积累而产生对动植物体产生毒害作用，因此人们对铜造成的环境污染也特别关注[32]。Wenhua Wang等[33]利用改性壳聚糖（MCS）修饰的银/金（Ag/Au）复合薄膜，研制了一种可重复使用的SPR传感器，可实现铜离子的快速检测。该研究采用四层Kretchmann半柱面棱镜结构，通过引入参比光束，提高了实验系统的灵敏度和稳定性。经过优化，MCS膜在传感器芯片冲洗4次后的溶胀速率＜9×10-4/min，在MCS膜经吸附Cu2+及多次冲洗后信号值下降＜1.5%。用0.5mmol/L的EDTA溶液对传感器进行5次洗脱后，洗脱率和容量率均在96%以上。经实验表明该方法Cu2+的检出限低至18ppb。

环境内分泌干扰物（endocrine disrupting chemicals，EDCs）是存在于环境中的能干扰人类或动物内分泌系统的外源性化学物质[34]。内分泌干扰物并不直接作为有毒物质给生物体带来毒害，而是通过拟激素或抗激素作用导致人类或动物的内分泌紊乱，甚至导致人类和动物生殖系统发育异常、生殖机能失常、神经系统发育延缓、智力损害甚至导致物种灭绝[35]。二噁英、多氯联苯及诸多农药均属于内分泌干扰物。Shimomura等[36]利用SPR技术建立了一种基于竞争性免疫分析手段的快速测定2，3，7，8-四氯二苯并-对-二噁英（2，3，7，8-TCDD）、多氯联苯（PCB）、除草剂阿特拉津的方法，三者的检测限分别为0.1、2.5及5ng/mL，并且每个样品分析时间仅需15min。

2.3 食品安全检测领域的应用

俞婧等[37]基于SPR技术建立了快速测定猪肉中磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine，SM2）残留的方法，该研究将SM2偶联到传感器芯片表面，通过优化检测条件，结果表明，建立的检测方法在低（10μg/kg）、（20μg/kg）、高（100μg/kg）三个浓度水平的回收率为87.6%～107.4%。样品检测结果经液相色谱-质谱/质谱法确证，表明该方法可用于猪肉中SM2的快速筛查分析。

李辉等[38]利用实验室自行研制的SPR系统，通过化学偶联，将莱克多巴胺衍生物固定于芯片表面，基于在一定浓度范围内的莱克多巴胺抗体与莱克多巴胺结合的响应值呈线性关系的原理，经过检测条件的优化，采用连续进样的检测方法对莱克多巴胺进行定量分析检测。结果表明，该方法的检测时间为15min，莱克多巴胺检测限＜4μg/L，IC50值为8.5μg/L。并且通过观察结合反应传感图，发现莱克多巴胺的抗体与莱克多巴胺之间的结合反应在检测时间之内远未达到饱和状态。因此后期可通过延长反应时间以扩大莱克多巴胺检测范围，降低检测限。

刘瑾等[39]利用SPR技术建立了牛奶中的氨苄青霉素残留检测方法，该研究从pH值、离子强度和配体浓度三个方面探讨、优化了氨苄青霉素-BSA固定至芯片表面的条件。通过检测不同浓度的氨苄青霉素水溶液和牛奶溶液，最低检测限分别达到了1.7ng/mL和1.8ng/mL，两者均低于欧盟规定的最大检出限4.1ng/mL，证明了该方法的可行性。

2.4 表面等离子体共振技术在药物研究中的应用

近年来，全球生物制药产业发展迅速，新的生物药分析检测技术也层出不穷，SPR作为新兴的生化分析检测工具，凭借着其出色的准确性、稳定性和高重复性，在药物筛选、药物作用机理研究、药物评价等方面得到越来越广泛的应用[13]。

亲环素A在许多细胞中发挥蛋白质折叠伴侣及胞内转运作用，有研究表明亲环素A可通过与HIV-1 Gag蛋白相互作用并增强病毒的感染性。亲环素A抑制剂如多环菌素A在体外可抑制HIV-1的复制[40]。Chen等[41]通过计算机辅助虚拟筛选及SPR分析技术，选择了12种小分子化合物作为候选亲环素A抑制剂。通过体外研究12种小分子化合物抑制亲环素A酰脯氨酸顺反异构酶（peptidylprolyl cis-trans isomerase，PPIase）活性，结果发现其中五种化合物（FD5，FD8，FD9，FD10 and FD12）具有抑制PPIase及HIV-1感染的活性。

人血清白蛋白是血浆中最为丰富的蛋白质，占了血浆所有蛋白总量的60%[42]，血清白蛋白能与许多内源及外源性化合物结合，从而起到重要的存储和转运作用[43]，药物进入人体后，与人血清白蛋白在体内可产生不同程度的结合，这种结合对药效学和药动力学起着重要的作用[44]。Frostell等[45]将人血清白蛋白固定于芯片表面，利用SPR技术分析了19种药物与血清白蛋白的结合作用，所得结果与已有报道一致。各药物以单浓度进样（80mM），分析各个药物与血清白蛋白结合作用，依据结合作用的强弱可将药物分成高、中、低三个组。该研究建立的方法可实现24h内筛选100个化合物，并且样品消耗量低至8nmol。

在对抗体类生物类似药与参照药进行比对研究时，抗体与抗原的亲和力是质量评价的一个重要指标。税雪等[46]利用表面等离子体共振技术比较分析了国产西妥昔单克隆抗体（Cetuximab）及国外已上市的西妥昔单抗Erbitux与重组人表皮生长因子受体（EGFR）的结合能力。结果显示，C225与Erbitux在与重组人EGFR的结合能力上，有相似的结合动力学特性，为生物类似药与参照药比对研究评价提供了依据。

3 SPR技术发展展望

自SPR技术出现以来，特别是自商品化的SPR分析仪投入市场以来，SPR技术就因其具有的独特优势在分子生物学研究、环境污染物检测、食品安全检测、药品研发等领域得到了越来越广泛的应用，SPR技术测定对象也已经覆盖了从小至金属离子到大至病毒乃至细胞[47-48]。此外，SPR传感器及分析仪研发也取得了长足的进步，通过引入新的传感方法[49]，进行新的结构设计[7]，或在传统分析仪的基础上提高仪器的性能和实用性[50]。均有效提高了SPR分析仪的灵敏度和精度。笔者认为SPR技术未来发展的方向除了继续扩大SPR技术检测应用领域以外，还要进一步探索加快SPR技术与其他已有技术方法的联用。Meyer等[51]将SPR技术与表面增强拉曼散射技术（surface-enhanced raman scattering，SERS）结合起来，制作了SPR-SERS联用仪并验证了该仪器应用的可行性。其研究成果为SPR技术应用开辟了全新的发展方向。SPR技术与其他技术联用也日趋广泛，如SPR技术与质谱技术联用可将SPR技术的药物筛选、配体垂钓功能与质谱的结构分析功能进行整合，提高药物筛选效率；SPR技术与电化学分析技术联用，有助于大大提高检测灵敏度，降低检测限。除此之外，加大新型芯片的开发力度，降低分析物与芯片基质表面的非特异性结合，提高分析的分辨率，开发更适宜小分子分析的芯片也将更加有力促进SPR技术的应用。