FOXA家族在恶性肿瘤中的作用研究进展

张偲昂，王明东，王 泽，陈文杰，金煜翔，赵学维，薛 磊

FOX家族被称之为叉头框(fork-head box)蛋白，其特征是具有一段长度为110个氨基酸，高度保守并且和果蝇叉头基因相应区域高度同源的DNA结合域。根据叉头框的序列可进一步分为FOXA～FOXS共19个亚族。FOXA家族最初从大鼠肝核细胞中提取，在2000年系统命名叉头框家族之前被称作肝核转录因子-3(hepatic nuclear factor-3，HNF-3)，包括FOXA1、FOXA2、FOXA3三个成员。FOXA家族的特征性叉头框结构由3个α螺旋及其两侧2个环形结构组成，又被称为“旋翼区”(wing-helix domain，WHD)。值得注意的是，FOXA的C末端能与组蛋白H3、H4相互作用，且旋翼区在结构上类似于组蛋白H1，该结构有助于FOXA与致密的染色质结合并使之松散。除FOXA本身的DNA结构域与染色质结合发挥作用外，其也可进一步促进染色质与其他转录因子结合从而发挥下游作用。因此，FOXA也被称为“先锋因子”。FOXA家族成员是内胚层形成以及相关器官如肝脏、胰腺、肺和前列腺等的正常发育所必须的，其还可以通过调节肝脏、胰腺和脂肪组织中的多个靶基因以调控能量代谢从而参与许多疾病的发生、发展过程[1]。此外，FOXA家族更是和恶性肿瘤的发生、发展以及转移等各个环节息息相关。目前关于FOXA1和FOXA2的研究较多，而针对FOXA3的研究较少，且多集中于胚胎发育、血糖、脂肪的代谢及相关疾病等方面。值得注意的是，在不同的肿瘤疾病进程中，FOXA家族各成员的表达及其作用并不相同，笔者就近年来FOXA家族与恶性肿瘤的相关研究进行综述。

1 FOXA在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中的作用

Wang等[2]系统地利用人肺腺癌A549细胞株的染色质免疫共沉淀技术(chromatin-immunoprecipitation, ChIP)结合二代测序即ChIP-Seq(ChIP-sequencing)数据，分析了多个转录因子结合位点，发现FOXA1作为一种重要的转录因子可能在肺癌转移起始阶段起重要作用，其可负性调节肿瘤的上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。该研究还发现在FOXA2启动子区有一个强的FOXA1结合位点，提示在A549细胞中存在FOXA1对FOXA2的潜在调控。Li等[3]研究发现，FOXA1在高侵袭性的A549细胞中表达升高，且相对于肿瘤原发灶，其在转移淋巴结中的表达更高。此外，在A549细胞系中干扰FOXA1可以抑制细胞的增殖并降低其侵袭、迁移能力。Deutsch等[4]研究发现在肺鳞状细胞癌中FOXA1也同样起致癌基因的作用，其在肺鳞状细胞癌中的表达与远处转移以及较差的预后有关，并且相比于未匹配原发肿瘤的肿瘤样本，在肺鳞癌患者脑转移标本中FOXA1的表达量较高。

FOXA2在肺癌中被认为是抑癌基因，过表达FOXA2可抑制肺癌细胞转移，促进其凋亡。Basseres等[5]利用免疫组化方法检测了173例原发NSCLC组织中的FOXA2表达情况，结果发现42例(24.2%)中FOXA2表达缺失，54例(31.2%)中低表达。Halmos等[6]发现FOXA2是抑癌基因C/EBPα的下游靶基因，且FOXA2在正常肺中表达强烈，但在所有肺癌细胞系中半数以上(15/25)表达消失。在人非小细胞肺癌NCI-H358细胞株中过表达FOXA2后，细胞增殖停滞，增殖克隆能力丧失，同时促进细胞凋亡。锌指转录因子Slug，又称为snail2，主要通过调控增加E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达从而使细胞维持正常上皮的特征以参与EMT。Tang等[7]研究发现FOXA2能够与Slug启动子结合后通过自身的转录激活域Ⅱ抑制Slug的转录，下调人肺癌细胞中FOXA2可以诱导肿瘤细胞发生EMT，反之FOXA2过表达则可以抑制EMT，进一步影响肺癌细胞的转移。此外，有研究通过对各公共数据库数据的分析，认为FOXA1和FOXA3在肺癌组织及细胞株中高表达，而FOXA2表达较低，并且三者均与较差的预后相关[8]。

2 FOXA在乳腺癌中的作用

乳腺癌是一类高度异质性的肿瘤，其分子分型包括Luminal A型、Luminal B型、人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor，HER)-2过表达型、基底细胞样型(三阴型乳腺癌属于此型)。FOXA1在乳腺癌细胞株中普遍高表达，这在雌激素受体(estrogen receptor，ER)阳性(Luminal A/B型)的乳腺癌患者中通常意味着更好的预后。一项研究分析了4 444例乳腺癌患者样本后发现FOXA1还与一些肿瘤临床预后较差的指标呈负相关，如肿瘤大小、分级，Ki67蛋白和HER-2蛋白的表达，基底细胞样亚型等，提示FOXA1是估计乳腺癌预后的独立危险因素[9]。究其原因，FOXA1是影响ER与染色质相互作用的决定性因素。Hurtado等[10]利用ChIP-Seq手段发现在同一种乳腺癌细胞系中，ER结合位点与FOXA1结合位点之间的重叠区域可达52%～58%。FOXA1作为基因转录调节的先锋因子，可以结合并松解位于重叠区域的致密核小体，进而利于ER与配体的结合。在接下来的乳腺癌MCF-7细胞株研究中发现，人为沉默FOXA1基因后，与对照组相比超过90%的ER结合位点信号强度至少降低了50%。研究还发现在雌激素敏感的乳腺癌细胞中，FOXA1的存在为他莫昔芬-ER结合所必须(他莫昔芬为抗雌激素药物，结构类似雌激素，能与雌二醇竞争ER并与之形成稳定的复合物)；而在他莫昔芬耐药细胞中，ER结合与配体无关，但同样依赖于FOXA1的存在。

对于ER阴性的乳腺癌，Ni等[11]利用了乳腺分子大汗腺型肿瘤(molecular apocrine tumours)的MDA-MB-453细胞系作为模型进行研究，这类细胞系的分子表型为ER(-)/雄激素受体(androgen receptor，AR)(+)/HER-2(+/-)，其信号调节和雄激素依赖性与前列腺癌细胞系类似。结果发现AR可以通过上调WNT7B分子的表达激活Wnt/β-catenin信号通路，随后诱导HER-3上调。HER-3与HER-2均为HER家族成员，它们可以形成异源二聚体并磷酸化触发信号级联从而促进肿瘤细胞的生长。Robinson等[12]研究发现AR发挥功能是依赖于FOXA1的，因为沉默FOXA1的表达后可以抑制AR的结合。此外，FOXA1还可以通过调控细胞周期对细胞生长产生抑制作用。一项研究通过对乳腺癌细胞株MCF-7和ZR-75-30运用ChIP技术证实FOXA1能结合到p21、p27基因启动子序列上，再通过克隆p21、p27的启动子，构建p21、p27启动子重组质粒进行共转染实验，结果提示FOXA1能促进p21、p27基因的转录[13]。Wolf等[14]也同样发现，FOXA1可以通过调控p27的转录来实现对乳腺癌细胞增殖的调控。除了被广泛研究的FOXA1，FOXA2在乳腺癌的发生、发展中也同样发挥着重要作用。Zhang[15]研究发现FOXA2可以通过促进E-钙黏蛋白并抑制E盒结合锌指蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2, ZEB2)表达的方式，抑制乳腺癌EMT的发生从而产生抑癌作用。Cao等[16]经研究认为，过氧化物酶体-γ共激活因子-1β(peroxisome gamma coactivator-1β, PGC-1β)的下调与FOXA2的过度表达可以通过调节PI3K-AKT-mTOR途径共同抑制乳腺癌细胞的功能。但也有研究却发现FOXA2可以促进基底细胞样型乳腺癌的发生，并增加复发率[17]。

3 FOXA在前列腺癌中的作用

FOXA1也可以通过调控AR所介导的转录过程从而在前列腺癌的发生、发展及转移中发挥作用。与乳腺癌不同的是，尽管同样是激素依赖性的肿瘤，FOXA1高表达却往往表示肿瘤预后不佳。Jain[18]通过对80例原发性和28例转移性前列腺癌组织研究(包括15对配对样本)，发现89%的转移性前列腺癌标本FOXA1高表达，相比之下原发灶仅有19%FOXA1高表达，并且FOXA1高表达与肿瘤大小、前列腺外浸润及淋巴结转移程度呈正相关。冯伟等[19]运用免疫组化的方法检测了35例前列腺癌以及21例良性前列腺增生的组织标本，发现前列腺癌组织中FOXA1的表达显著高于良性前列腺增生组织，并且FOXA1与前列腺癌患者的TNM(tumor node metastasis)分期、Gleason评分正相关，也说明FOXA1在前列腺癌中扮演着促癌基因的角色。此外，FOXA1/A2还可以促进AGR2蛋白(anterior gradient protein 2)的表达，而AGR2可以增加前列腺癌细胞的侵袭性。ErbB3结合蛋白1(ErbB3-binding protein 1, EBP1)可以拮抗FOXA1/A2的诱导，抑制AGR2的表达，从而减弱肿瘤细胞转移的能力。

4 FOXA在肝细胞癌中的作用

女性的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)明显低于男性，诸多研究已经证明雌激素对肝细胞具有保护作用，而雄激素相反可促进肝细胞癌的发生。FOXA1/A2为建立前肠内胚层和启动肝脏发育所必须。Li等[20]利用二乙基亚硝胺诱发FOXA1/A2基因缺陷的小鼠肝癌，结果发现雌性FOXA1/A2缺陷型小鼠肿瘤较对照组明显增大，而雄性FOXA1/A2缺陷型小鼠较对照组肿瘤较小，即失去了肝癌致病过程的两性差异。进一步的研究发现FOXA1/A2和ER或AR对靶基因的共调控在正常雌性或雄性小鼠的肝癌发生过程中分别增加，但这种共调控在FOXA1/A2缺陷型小鼠中并不存在。因此，雌激素对HCC的抵抗作用和雄激素对HCC的促进作用均取决于FOXA1/A2。有研究认为，FOXA1作为肿瘤抑制因子可以直接抑制PIK3R1(phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 1)基因的转录活性，PIK3R1基因负责编码磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)的p85α亚基，FOXA1正是通过此种机制抑制PI3K/Akt信号传导，从而对男性患者HCC的增殖、迁移和侵袭产生负面调节作用[21]。Wang等[22]发现FOXA2在肝癌组织中表达降低，进一步体外、体内的试验均证实了FOXA2可以抑制HCC的侵袭和转移。研究还发现FOXA2可下调基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9, MMP-9)的表达，提示FOXA2可能是因此抑制肝癌转移。MMP-9属于基质金属蛋白酶家族一员，是一类结构中含Zn2+和Ca2+的蛋白水解酶，被认为是肿瘤发生侵袭转移的始动因素。Liu等[23]发现肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor, TNF-α)的一个重要的下游激酶IκB激酶的α亚基(IKKα)可以使FOXA2发生磷酸化而失活，导致NUMB蛋白表达降低并进一步激活下游NOTCH通路，促进细胞增殖和肿瘤发生。肝癌细胞中FOXA2，IKKα和活化的NOTCH1蛋白(NOTCH1是NOTCH基因编码的一种跨膜蛋白受体，与恶性肿瘤的发生、发展关系密切)水平显着高于正常肝组织，并且FOXA2分别与IKKα和活化的NOTCH1蛋白表达呈正相关，由此参与炎症介导的肝细胞癌致病过程。此外，汪子力[24]发现FOXA2可以通过调节p53和p21的转录影响肝癌细胞增殖。李正平等[25]研究发现FOXA2可以调节E-钙黏蛋白的表达并进一步调节EMT从而发挥抑癌的作用。最新的研究还发现FOXA2抑制另一叉头框蛋白FOXM1的表达进而抑制其诱导的致瘤作用，还可抑制Ras基因诱导的涉及FOXM1的肝癌进展[26]。FOXM1对HCC的发展至关重要，其过表达与不良预后相关。反之FOXM1也可以抑制FOXA2的表达，两者在HCC的进展中扮演相反的角色。

5 FOXA在胰腺癌中的作用

FOXA1和FOXA2，对于许多内胚层衍生器官(包括胰腺)的上皮分化至关重要。Song等[27]研究发现在人胰腺导管癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDA)样本中，FOXA1/A2在从正常到分化良好的所有癌细胞的上皮细胞中均表达，而在未分化癌细胞中表达丢失。在PDA细胞系中，不管抑制FOXA1或FOXA2，均可以诱导胰腺导管癌细胞发生EMT，而过表达FOXA2可以重新激活E-钙黏蛋白从而维持正常上皮的表型。通过对胰腺未分化癌细胞的研究发现，这种作用实际上是通过去甲基化重新激活内源性的FOXA2而实现的。因此，FOXA1/A2与胰腺癌转移密切相关。

6 FOXA在食管癌中的作用

研究发现FOXA1在食管癌中高表达并与广泛的淋巴结转移有关。此外，有研究发现FOXA2在Barrett食管、食管异型增生以及食管腺癌中表达上调[28]。Watts[29]研究显示，FOXA2可以通过调节X1因子(regulatory factor X1, RFX1)的表达水平从而在Barrett食管向食管腺癌发展的过程中起到一定作用。Chen等[30]对FOXA3在食管癌中的作用进行了研究，结果提示FOXA3在食管癌及Barrett食管中高表达，下调FOXA3后肿瘤的侵袭转移能力受到抑制。研究还发现FOXA1/A2的表达水平也随之下降，而过表达FOXA1或FOXA2后，食管癌细胞的侵袭转移能力也得到恢复。

7 FOXA在结直肠癌中的作用

Ma等[31]通过对90例结直肠癌组织标本的研究，发现FOXA1的阳性表达与肿瘤体积、淋巴结转移及更晚的肿瘤分期有关，并且是预后不良的独立危险因素。最近有一项对多达403例结直肠癌组织标本的研究，也证实了FOXA1与肿瘤分化、浸润深度、淋巴结转移、更晚的肿瘤分期和低生存率相关，并且FOXA1阳性肿瘤的平均Ki-67指数值显著高于FOXA1阴性肿瘤[32]。体外细胞实验发现敲除FOXA1后可以激活ADP-核糖聚合酶，上调p53基因，下调BH3和Mcl-1蛋白，从而抑制了肿瘤细胞侵袭，同时诱导细胞凋亡。这些结果表明在结直肠癌中FOXA1可以通过调节细胞生存数量以促进肿瘤的发展。此外，在结直肠癌中，FOXA与上皮标记基因的增强子相关，在维持正常上皮结构功能中发挥着重要作用[33]。Snail1(锌指转录因子的成员之一)可以通过直接抑制FOXA1并触发所有FOXA家族成员的下调，从而促进EMT的发生。

8 FOXA在其他肿瘤中的作用

FOXA1在甲状腺未分化癌中高表达并被认为是潜在的致癌基因。有研究利用免疫组化技术检测了67例甲状腺髓样癌(包括1例降钙素阴性髓样癌)标本，结果所有67例标本中FOXA1均是强阳性表达[34]。Kim等[35]研究显示甲状腺乳头状癌细胞中FOXA2的表达明显下降。在脑胶质瘤中，FOXA1的表达与不良预后相关并可促进肿瘤的增殖及转移[36]。相反，FOXA2则可以抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭性[37]。FOXA2还可以抑制卵巢癌和胃癌的增殖、迁移侵袭能力[38]。此外，研究发现FOXA2在子宫恶性肿瘤包括子宫肉瘤中存在频繁突变，提示FOXA2可能也参与了子宫恶性肿瘤的致癌进程[39]。

9 总结与展望

综上所述，FOXA家族与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，且在不同的肿瘤中，FOXA家族基因的表达及其作用均不相同。FOXA因其与ER、AR密切的作用关系，在乳腺癌、前列腺癌以及肝癌这类激素相关性肿瘤的致病机制中扮演了核心的角色。从HNF-3到叉头框蛋白A已经有20年，期间研究者们进行了不懈的努力，对其在各种恶性肿瘤中的作用及机制不断探索，相信通过今后对FOXA家族研究的进一步深入，能为肿瘤的诊治带来新的收获。