外泌体在肩袖损伤修复中的作用

王凯，李卓扬，林向进

（浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310003）

肩袖损伤是临床常见的肩关节疾病之一，由内在和外在因素引起[1]。肩袖损伤如未及时治疗，受损肌腱会继发变形和萎缩，造成永久性功能障碍。肩袖中肌腱-骨骼的特殊连接结构被称为“腱骨结构”，此结构从软腱组织到硬骨骼分为四个过渡梯度[2]：肌腱、非矿化的纤维软骨、矿化的纤维软骨和骨骼。四个梯度矿化程度逐渐增加，肌胶原纤维逐渐减少。腱骨结构将机械应变沿着过渡方向分布，以加强肌腱和骨骼之间的结合[3]。肩袖损伤后腱骨结构的修复是通过瘢痕组织形成而不是原有结构再生[4]，新生的瘢痕组织缺乏矿物质分布和胶原纤维组织梯度导致腱骨结构抗张能力变弱，容易发生肌腱二次撕裂[5]。近年来，临床上对肩袖损伤修复的改进集中在手术和缝合技术上，对腱骨结构再生尚无策略，因此收效不甚理想。然而近期有研究发现，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在肩袖损伤的病理刺激下（包括缺氧）可以触发外泌体释放，携带再生介质至细胞外基质，保护肌腱基质免受损伤[6]。腱骨愈合是肩袖损伤修复的关键，尽管已有研究表明，外泌体在肩袖损伤修复中的积极作用，但目前的研究尚处于早期阶段，作用机制仍不明确。本文将综述外泌体在肩袖损伤领域的研究现状和进展，发掘其在肩袖修复中的潜力。

1 外泌体的结构

外泌体（exosomes）是细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）的一种，Johnstone 等[7]最早于 1983 年在绵羊网织红细胞中发现，是直径为30～100nm的多形性囊泡样小体。较大（直径＞100nm）的微囊泡一般是细胞膜直接分离而来[8]，外泌体则首先由细胞膜向内凹陷形成胞内小泡，内含部分细胞质，形成早期内体，早期内体逐渐成熟后选择性地分拣胞质内蛋白质、核酸、脂质等，发育成晚期内体后，其微粒体膜向内出芽形成多囊泡内体 （multivesicular body，MVB）。MVB形成后一般有两种结局：与溶酶体膜融合后其内容物被水解，以及与细胞膜融合后存在于多囊泡内体中的囊泡被释放到胞外，形成外泌体[9]。

外泌体可由癌症细胞、内皮细胞、免疫细胞和包括骨骼肌在内的多种细胞等释放[10]，是细胞内通讯的高效载体，以自分泌或旁分泌的方式传递蛋白质、脂质、miRNA mRNA编码的信息。产生外泌体的细胞根据不同激活响应和压力诱导刺激而产生不同数量的外泌体，不同组织来源的外泌体释放其独特含量的信息来影响细胞外基质环境[11]。在肌肉骨骼系统，外泌体多由间充质干细胞分泌释放[12]，携带调节蛋白的mRNA，即miRNA，被传递到各种细胞如成纤维细胞，以改善细胞表型和功能，参与各种生物学过程如免疫反应、细胞增殖、细胞迁移和血管生成[13]。

在体内，间充质干细胞可存在于骨髓、脂肪组织、脐带血、Wharton’s胶和滑囊液中[14]。 在特殊的微环境中，间充质干细胞能够自我更新和分化为多种细胞表型，包括软骨细胞、肌腱细胞和成骨细胞[15]，其以优异的旁分泌、免疫调节和血管再生潜力诱导软组织和硬组织（骨骼）的生长[16]。在肩袖损伤关节镜修复手术中，铆钉放置时可得到骨髓间间充质干细胞[17]，有研究表明，将其应用于肩袖撕裂修复时肌腱功能得到明显改善[18]。Sevivas等[19]通过将MSCs（其中包含从MSCs释放的细胞因子、生长因子和外泌体）和肌腱细胞共培育，证实了骨髓来源的MSCs在肩袖肌腱撕裂修复中的作用。体外实验中表现为肌腱细胞密度和活力增加，体内实验则表现出了更高的肌腱成熟度、断裂伸长率和较低的硬度，改善了肩袖生物力学和组织学功能。Kim等[20]的研究比较了传统肩袖损伤修复和注射脂肪来源MSCs修复的患者，在术后12个月的随访中，MSCs分泌物治疗组的二次撕裂率显著低于传统治疗组（14.3% VS 28.5%）。这些研究表明，MSCs分泌物可能通过调节局部免疫和生物活性环境使肌腱细胞增殖和分化，提高肌腱愈合程度，改善肩袖修复。

2 外泌体的释放

人类活检和动物模型相关实验证据表明，缺氧是肩袖肌腱损伤病理学开始和进展的主要诱因。一方面，肌腱组织的血管特性、极端缺氧触发凋亡特性会加速肌腱细胞的坏死；另一方面，缺氧激发了HIF-1α介导的炎症和修复反应[21]。但同时，缺氧环境能够促使MSCs和常驻肌腱干细胞的迁移和增殖，从而促进肌腱愈合[22]，因此MSCs外泌体（MSCs-exos）是联系受损组织细胞和周围MSCs、启动组织再生的关键介质[23]。Hu等[24]进一步证明了低氧下外泌体的释放，以剂量依赖的方式触发了邻近成纤维细胞群上调I型胶原蛋白的合成并促进细胞外基质重塑和局部组织修复。由此推断，肩袖肌腱撕裂造成了局部低氧环境，诱导了间充质干细胞MSCs的释放，包含蛋白信息的外泌体至细胞外基质，保护肌腱组织免受损伤并加速组织再生反应。

3 外泌体在肩袖损伤修复中的作用

3.1 对血管生成的作用 外泌体释放的促血管生成因子包括：促血管生成因子，包括肝素结合性生长因子（HBEGF）、神经营养蛋白（NT-3）、血小板衍生生长因子（PDGF-ββ）、胎盘生长因子（PLGF）、干细胞因子（SCF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）等，以及血管生长因子，包括粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、血管内皮生长因子受体（VEGFR2）等[25]。综合许多研究证明，脂肪来源的MSCs-exos释放的因子不仅会引起现有血管舒张[26]，还将作用于肩袖损伤修复后组织的血运重建[25]，提供更好的组织灌注，加速伤口愈合最终降低二次撕裂风险。

3.2 对瘢痕形成的作用 瘢痕组织由于胶原纤维的紊乱和错位，导致新生伤口愈合功能丧失[27]。Wang等[28]分析了小鼠模型中静脉注射脂肪来源MSCs-exos瘢痕组织愈合的影响，结果显示，MSCsexos减少了瘢痕面积，增加了Ⅲ型胶原/Ⅰ型胶原的比例，TGF-β3与TGF-β1的比例也提高，这正是胶原形成的重要信号。此外还观察到基质金属蛋白酶-3（MMP-3）和基质金属蛋白酶-1（MMP-1）的组织抑制剂水平上调，从而提高了细胞外基质重塑并抑制了瘢痕组织形成。对MMPs和外泌体的进一步研究发现，许多外泌体携带MMP9，MMP9可促进胶原基质从层状结构转向纤维状结构[29]，同样证实了外泌体对瘢痕组织形成的影响[30]。

3.3 对炎性反应的作用 人体滑囊液中分离出的外泌体具有骨关节炎特有的miRNA谱，滑膜成纤维细胞分泌的外泌体被关节软骨吸收，并诱导一系列病理变化和分子变化，例如细胞外基质合成基因（ACAN）和Ⅱ型胶原α1（COL2A1）的下调[31]，基质金属蛋白酶13（MMP13）和金属蛋白酶5（ADAMTS-5）的上调[32]，以及IL-6的产生[31]。有趣的是，与滑囊液中分离出的外泌体相比，MSCs-exos似乎发挥了相反作用，如通过增加软骨细胞外基质成分（即Ⅱ型胶原蛋白，软骨寡聚基质蛋白）的产生来维持软骨细胞细胞外基质的合成降解平衡[33]，甚至加速软骨修复[34]。除了维持细胞外基质平衡外，其携带的Wnt家族成员5a/5b还激活了Wnt信号转导通路，靶向下游YAP蛋白途径，以增强软骨细胞的增殖和迁移，进而减缓早期骨关节炎的进展，防止对膝关节软骨的严重损害[35]。

3.4 对肌肉变性的作用 Bier等[36]研究了胎盘来源的MSCs-exos对 Duchenne肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）患者成肌细胞和小鼠成肌细胞的影响，证明外泌体有助于缓解肌肉变性退化。实验中发现，MSCs-exos增加了体外成肌细胞分化，抑制了DMD成肌细胞特征性的纤维蛋白原基因表达，提高了肌肉发育高水平表达的卵磷脂含量[37]。小鼠肌内移植MSCs-exos同样出现了卵磷脂表达增加，并减少肌酸肝激酶表达，降低心肌和膈肌TGF-β的水平和纤维化，抑制炎症反应等[36]。

4 作为载体材料的应用

外泌体可以携带受体细胞摄取的各种核酸和蛋白质，因此它们是理想的药物载体。具有毒性或免疫原性的药物可以封装在外泌体中靶向运送至目标细胞，以避免全身毒性，如Pascucci等[38]在外泌体中装载了紫杉醇递送至耐药细胞，使细胞毒性增加50倍以上。另有一项研究使用了MSCs-exs装载的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）治疗缺血性心脏病[39]，在大鼠模型中，该组显著增加了心肌中EPCs的植入量和存活率，明显改善了左室舒张末功能。尽管目前尚无 MSCs-exos装载体治疗肌腱撕裂的动物模型或人体相关试验，但有限的研究给未来治疗肩袖损伤降低二次撕裂风险提供了新思路。

5 结论与展望

尽管手术和缝合技术不断改进，对肩袖损伤修复的认识不断深入，但其较低的手术成功率和二次撕裂的高风险仍然是临床上的难题，包括近年来出现的一些修补或支架材料，都难以达到减轻患者疼痛、恢复肌腱功能的要求。外泌体作为细胞外基质的组成成分在促进血管生成、抑制瘢痕组织形成、抑制炎症免疫反应、减缓肌肉变性退化等过程中扮演着重要角色。但目前外泌体对肩袖损伤愈合作用的研究尚处于早期阶段，还需大规模队列或前瞻性实验进一步探索。同时，外泌体展现了作为生物载体材料高循环稳定性、高生物相容性、低免疫原性和低毒性的巨大优势，且其具有大规模生产和制造的可能性[40]，这些都为提高肩袖肌腱愈合再生提供了研究方向。