微量样本中N-糖组分析技术的发展与应用

孟 波，李晓宇，崔新玲，应万涛*，钱小红1，*

(1.广东药科大学 药学院，广东 广州 510006；2.军事科学院军事医学研究院生命组学研究所，蛋白质组学国家重点实验室，北京蛋白质组研究中心，国家蛋白质科学中心(北京)，北京 102206；3.北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京 100022)

蛋白质糖基化修饰是最常见的蛋白质翻译后修饰(Protein post-translational modification,PTM)之一[1]，根据其连接的氨基酸不同分为N-糖基化修饰和O-糖基化修饰两种[2]，其中N-糖基化修饰在蛋白质稳定性、蛋白质间信号传导、细胞生长、蛋白质活性调节等方面起着重要的作用[3-4]，N-糖蛋白还是主要的肿瘤治疗靶点和生物标志物来源，如前列腺癌中的前列腺特异性抗原 PSA[5]，卵巢癌中的肿瘤抗原CA125[6]，乳腺癌中的Her2/neu[7]和肝癌中的分子诊断标志物AFP[8]。N-糖基化修饰一直是单克隆抗体药物质控、肿瘤标志物发现和临床蛋白组学研究的热点，但蛋白N-糖基化修饰微观和宏观的不均一性、样本制备要求起始量高、糖链标准品缺少等原因，限制了糖组学的发展和应用。现阶段，N-糖组学样品制备的常规过程，需经过蛋白的提取、变性、还原烷基化、蛋白消化、N-糖链的释放及N-糖链的富集等多个步骤，容易造成糖链组分的损失。2014年Kulak等[9]研发了一种In-Stage Tip方法，用于在单个封闭空间内中进行蛋白样品处理，该方法将样品制备的多步骤合并成单一步骤用于蛋白质组学的研究，在一定程度上降低了蛋白样品制备的起始量。2016年Chen等介绍了一种简单和集成的基于Spintip的蛋白质组学技术[10],该技术较过滤辅助样品制备(Filter-aided sample preparation，FASP)方法优化了蛋白样品制备的实验步骤，同时实现了肽段的梯度洗脱。虽然近年来蛋白质组学样本制备方案有了很大的进步，但是将这些方案用在N-糖链的样本制备上仍缺乏系统研究。液相色谱法和质谱法为目前常用的两种N-糖链检测技术。液相色谱法虽然可以很好地对N-糖链进行检测，但操作时间长、N-糖链需求量高，需要大量的糖蛋白，在很多情况下难以获取足够的蛋白进行N-糖链的样品制备，特别是对于临床上的微量体液标本、病理切片、穿刺样本等。因此，需要建立低损失的蛋白消化、N-糖链释放和富集的一体化技术，结合快速灵敏的N-糖链分析方法以实现微量糖蛋白N-糖组分析。本研究尝试建立了针对微量样本的N-糖链制备技术(N-Glycan preparation technology,GPAT),用以降低N-糖组学研究的起始蛋白量。通过人免疫球蛋白G(IgG)和人肝癌HepG2细胞蛋白，验证了GPAT对单纯样本和复杂样本N-糖组分析的可行性，并进一步将此方法应用于6例健康人(3例男性，3例女性)的尿蛋白的N-糖组分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker Ultraflex基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(MALDI-TOF MS，美国Bruker公司)；离心机和冷冻干燥离心机(美国Thermo公司)；微型个人离心机-Multi Spin(日本TOMY公司)；JY 92-Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技公司)；亲水相互作用色谱填料(HILIC)和反相色谱填料(C18)(天津博纳艾杰尔科技公司)。

IgG标准蛋白、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、氯乙酰氨(CAA)、三氟乙酸(TFA)、肽-N-糖苷(PNGase F)、尿素(UA)(美国Sigma公司)；胰蛋白酶(Trypsin,测序级)(美国Promega公司)；乙腈(ACN)(美国Merck公司)；2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)(美国Bruker公司)；Milli-Q去离子水制备系统(美国Millipore公司)；其它化学品均为分析纯。

1.2 HepG2细胞培养与蛋白提取

HepG2细胞采用含有10%胎牛血清的高糖培养基(DMEM)在37 ℃、5% CO2环境下培养，待其生长至直径10 cm表面皿的80%时，胰蛋白酶消化回收细胞。然后，使用1×PBS对获得细胞进行3次洗涤去除培养基，再加入1 mL 8 mol/L UA溶解在0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.5)中重悬细胞,然后将其置于超声波细胞粉碎机中进行细胞蛋白提取：超声功率200 W，工作1 s，间隙2 s，共99个循环。提取的蛋白应用Bradford法测定浓度，最后按照所需的量分装，置于-80 ℃冻存备用。

1.3 人尿蛋白的获取

尿液样本来自健康男性和女性各3例(年龄25～30岁)，均为空腹晨尿的中段尿，收集至离心管中，于4 ℃下12 000 g离心15 min。取上清液与预冷丙酮混合，于-20 ℃下过夜。将预冷过夜的混合物取出，在4 ℃下2 000 g离心5 min获得蛋白沉淀，加入8 mol/L UA缓冲液复溶蛋白。蛋白用Bradford法测定浓度，最后按照所需的量分装，置于-80 ℃冻存备用。

图1 GPAT样品处理装置和流程Fig.1 GPAT sample processing unit and proceduresreaction chamber A:digestion of proteins,release of N-glycans;reaction chamber B:enrichment of N-glycans

1.4 GPAT的设计及操作

如图1所示，整个装置由反应室A和反应室B组成，其制作成本低，制作时间短，在2～3 min内即可制作完成整个装置。反应室A：在100 μL Tip尖端填一层筛板后引入C18填料，再在填料上方加一层筛板,依次使用纯乙腈、50%ACN+0.1%TFA、0.1%TFA对其活化。反应室A主要用于蛋白的还原、烷基化、酶解、切糖以及N-糖链的分离。反应室B：在200 μL Tip尖端加载一层筛板，然后将HILIC填料引入Tip中,依次使用1%TFA、80%ACN+1%TFA对其活化。反应室B主要用于N-糖链的富集。两个反应室活化过程中均使用Multi Spin除去液体。

GPAT操作流程：取10 μg 溶解于8 mol/L UA的蛋白加入到活化好的反应室A中，同时加入由100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解的TCEP和CAA，终浓度分别为10 mmol/L和15 mmol/L,将其放入37 ℃恒温箱中反应1 h。待反应完成后，加入适量100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)使反应体系中尿素浓度低于2 mol/L,然后按蛋白∶酶=50 μg∶1 μg比例加入Trypsin酶，放入37 ℃恒温箱中消化16 h。反应完成后，按蛋白∶酶=20 μg∶1 U的比例加入PNGase F酶并在 37 ℃恒温箱中切糖2 h。反应完成后，加入TFA使体系终浓度为0.1%,离心收集酶切液。加入和酶切液等体积的0.1%TFA，2 000 g离心1 min，将N-糖链组分洗脱至反应室B中，加入ACN和TFA使反应室B体系变为80%ACN+1%TFA,2 000 g离心 90 s使N-糖链与HILIC结合，加入80%ACN+1%TFA洗脱非糖链物质。最后，加入0.1%TFA洗脱N-糖链，收集组分待测。

1.5 FASP样本制备流程

1.5.2 N-糖链的富集用EP管称取5 mg的HILIC填料，先用0.1%TFA活化填料3次，每次10 min；再用80%ACN+0.2%TFA溶液平衡填料3次，每次10 min。将热干的含有N-糖链的样品复溶于80%ACN+0.2%TFA溶液，并与填料混合，于室温下旋转结合2 h。然后转入到自制富集小柱，3 000 g离心1 min。用80%ACN+0.2%TFA溶液再洗1次去除非特异性结合的杂质，最后用0.1%TFA洗脱3次，得到纯化的N-糖链。参照2018年Zhang等[12]使用的酸法去除N-糖链的唾液酸。

1.6 MALDI-TOF MS分析

采用对MALDI-TOF MS对N-糖链样品进行分析。使用肽校准品(Bruker)进行外部校准，选择2,5-DHB作为基质(用70%ACN+0.1%TFA溶解的1 mmol/L NaCl溶解配制，终浓度为20 mg/mL)，使用水溶解N-糖链样本，取1 μL样品点于洁净的不锈钢靶上，待自然干燥后取1 μL基质点靶，待样品与基质自然结晶后推入离子源待测。所有样品的激光强度保持恒定，累加1 500张谱图，采用正离子反射模式对N-糖链进行分析。MALDI-TOF MS数据采用FlexAnalysis 3.3软件进行分析，糖型采用GlycoWorkbench 2.0软件进行分析。

2 结果与讨论

2.1 IgG N-糖组分析

图2 10 μg IgG采用GPAT获得的N-糖链的MALDI-TOF MS谱图Fig.2 10 μg IgG N-glycan MALDI-TOF MS spectra obtained with GPAT the glycoforms corresponding to each molecular weight are labeled;the N-glycan structure simple map display method uses the Consortium for Fuctional Glyomics(CFG) standard to display the graphical rules;the symbols represent the following meanings:“”D-galactose；“”D-mannose；“”N-acetyl-D-glucosamine；“”L-fucose.

在基于质谱的N-糖组分析中，通用的FASP样品制备方案对于蛋白起始量要求很高，而N-糖链释放前蛋白复杂的处理步骤,以及N-糖链富集前对N-糖链的热干、重溶处理，不仅时间长且会造成样品的损失和污染。本研究致力于降低样品制备的蛋白起始量，减少样品制备时间，以满足基于质谱的快速、微量蛋白的N-糖组分析。还原剂TCEP和烷基化剂CAA相容，可以同时使用。因此，选用TCEP和CAA同时加入反应体系中对蛋白进行还原和烷基化处理，以达到简化操作步骤、缩短操作时间的目的。由于GPAT是在离心机上进行，因此可以实现样品的高通量分析。而对于N-糖链的富集,本研究在实验室前期研究结果[13]的基础上进行了优化，使N-糖链洗脱和富集可以实现无缝衔接，减少了常规的N-糖链富集时间和操作步骤，降低了N-糖链的损失。

图3 10 μg HepG2细胞提取蛋白采用GPAT方法制备N-糖链得到的MALDI-TOF MS谱图Fig.3 MALDI-TOF MS spectra of N-glycans prepared by GPAT protocol for 10 μg HepG2 cell extracts R1,R2,and R3 are three replicate experiments,and the glycoforms corresponding to each molecular weight are labeled

IgG是分子量约为150 kDa的糖蛋白，分子为Y型，由两条重链和两条轻链组成，其中重链分为抗原结合区(Fab)和抗体结合区(Fc)。Fc段具有一个N-糖基化修饰位点(含量约为3%～4%)，该位点的N-糖链修饰比较保守，因此，使用IgG验证GPAT对于单纯蛋白N-糖链制备的可行性。由于唾液酸易带负电，因此在质谱检测时会抑制N-糖链的信号甚至导致N-糖链无法检出，所以本实验对所有N-糖链进行了酸法去除唾液酸。采用GPAT和FASP方法对分别对IgG进行N-糖组分析。采用GPAT分别对2、5、10、15、20 μg的 IgG进行N-糖组分析，同时采用FASP方法分别对10、15、20、50、100 μg的IgG进行N-糖组分析，得到两种方法的IgG蛋白起始量分别为10、50 μg。如图2所示，采用GPAT对10 μg IgG进行N-糖组分析，获得了20种N-糖链,这与用FASP方法以50 μg IgG为起始量得到的结果一致。由此，在得到相同N-糖组分析结果的基础上，GPAT方法所需要的蛋白起始量更低。

2.2 HepG2细胞提取蛋白的N-糖组分析

N-糖基化修饰在细胞、组织、分泌体系等蛋白中具有重要的功能性作用，因此研究这些蛋白样本的N-糖组分布具有重要的意义。细胞、组织等样本含有多种蛋白，蛋白成分复杂，这些复杂蛋白成分中也含有丰富的N-糖链信息。本研究以8mol/L UA提取人肝癌HepG2细胞系蛋白，并采用GPAT对其进行N-糖组分析。首先，根据“2.1”的实验结果，采用10 μg HepG2细胞提取蛋白进行N-糖链的制备,并进行3次重复实验。如图3所示，3次实验均鉴定到39种N-糖链。对3次重复实验结果两两进行相关性分析，结果如图4所示，其相关系数r2=0.953～0.976，说明方法具有很好的重复性。同时以2、5 μg蛋白为起始量采用GPAT方案制备N-糖链，MALDI-TOF MS分析结果均未得到N-糖链信号。

2.3 健康人尿蛋白N-糖组分析

尿液易于获取，并且可以反映肾脏滤过蛋白质的功能，因此，尿液是公认的疾病诊断、监测和预后评价样本理想来源[13-14]。尿液中可作为疾病诊断标志物的多为微量蛋白，例如，健康人尿中微量白蛋白最低含量为20 μg/mL，因此,常用的FASP方法需要基于大量的尿液样本来获取尿蛋白N-糖链信息。本研究采用GPAT方法，对从6例健康人(3例男性，3例女性)的500 μL尿液里提取的10 μg蛋白进行N-糖链制备。MALDI-TOF MS分析结果如图5所示，在去除唾液酸异质性的基础上，男性和女性尿蛋白均鉴定到了49种N-糖链且结构类型一致。如图6所示，对3例男性和3例女性尿液样本的实验结果进行皮尔森相关性分析，组内分析结果为女性r2=0.938～0.958,男性r2=0.948～0.964，说明组内3次生物学重复有很好的重现性。男性和女性组间皮尔森相关性分析结果的平均r2=0.924。组间相关性小于组内相关性，说明N-糖链的相对丰度在男性和女性之间存在差异。对男性和女性尿蛋白N-糖链进行定量分析，其结果如表1所示。男性和女性尿蛋白N-糖链中存在2种差异糖型，分别为HexNAc(3)Hex(3)和HexNAc(7)Hex(9)(P<0.01)。本实验样品例数较少，进一步加大样品例数后，将有望发现生理病理过程中相关的差异表达糖链信息。

图6 3例男性和3例女性尿蛋白N-糖组分析结果进行皮尔森相关性分析Fig.6 The results of 3 males and 3 females were analyzed by pearson correlation analysis F1,F2 and F3 represent 3 different healthy females,and M1,M2 and M3 represent 3 different healthy males(F1、F2、F3代表3例不同的健康女性，M1、M2、M3代表3例不同的健康男性)

3 结 论

通过GPAT技术对10 μg IgG和10 μg HepG 2细胞提取蛋白进行N-糖组分析，分别鉴定到20种和39种N-糖链，证明了GPAT适用于微量蛋白N-糖组分析。将GPAT技术应用于健康人尿蛋白N-糖组分析，鉴定到49种N-糖链。同时对男性和女性鉴定到的各N-糖链进行差异分析，结果显示HexNAc(3)Hex(3)和HexNAc(7)Hex(9)为差异显著糖型。GPAT技术可以很好地应用于微量蛋白的N-糖组分析，具有操作步骤更少、操作时间更短、样本制备起始蛋白量更低，可以实现样品高通量分析的优点。但GPAT在分析含有唾液酸的N-糖链，适用于各种蛋白溶剂方面依然存在不足，在后续的研究中将进行改善。

表1 尿蛋白N-糖链MALDI-TOF MS相对定量结果Table 1 Relative quantitative results of urinary protein N-glycans by MALDI-TOF MS

Hex(己糖)；HexNAc( N-乙酰己糖胺)；Fuc(L-岩藻糖)