微量样本中N-糖组分析技术的发展与应用

2020-01-08 07:04李晓宇崔新玲应万涛钱小红1
分析测试学报 2019年12期
关键词:糖链糖基化尿蛋白

孟 波,李晓宇,崔新玲,应万涛*,钱小红1,*

(1.广东药科大学 药学院,广东 广州 510006;2.军事科学院军事医学研究院生命组学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,国家蛋白质科学中心(北京),北京 102206;3.北京工业大学 生命科学与生物工程学院,北京 100022)

蛋白质糖基化修饰是最常见的蛋白质翻译后修饰(Protein post-translational modification,PTM)之一[1],根据其连接的氨基酸不同分为N-糖基化修饰和O-糖基化修饰两种[2],其中N-糖基化修饰在蛋白质稳定性、蛋白质间信号传导、细胞生长、蛋白质活性调节等方面起着重要的作用[3-4],N-糖蛋白还是主要的肿瘤治疗靶点和生物标志物来源,如前列腺癌中的前列腺特异性抗原 PSA[5],卵巢癌中的肿瘤抗原CA125[6],乳腺癌中的Her2/neu[7]和肝癌中的分子诊断标志物AFP[8]。N-糖基化修饰一直是单克隆抗体药物质控、肿瘤标志物发现和临床蛋白组学研究的热点,但蛋白N-糖基化修饰微观和宏观的不均一性、样本制备要求起始量高、糖链标准品缺少等原因,限制了糖组学的发展和应用。现阶段,N-糖组学样品制备的常规过程,需经过蛋白的提取、变性、还原烷基化、蛋白消化、N-糖链的释放及N-糖链的富集等多个步骤,容易造成糖链组分的损失。2014年Kulak等[9]研发了一种In-Stage Tip方法,用于在单个封闭空间内中进行蛋白样品处理,该方法将样品制备的多步骤合并成单一步骤用于蛋白质组学的研究,在一定程度上降低了蛋白样品制备的起始量。2016年Chen等介绍了一种简单和集成的基于Spintip的蛋白质组学技术[10],该技术较过滤辅助样品制备(Filter-aided sample preparation,FASP)方法优化了蛋白样品制备的实验步骤,同时实现了肽段的梯度洗脱。虽然近年来蛋白质组学样本制备方案有了很大的进步,但是将这些方案用在N-糖链的样本制备上仍缺乏系统研究。液相色谱法和质谱法为目前常用的两种N-糖链检测技术。液相色谱法虽然可以很好地对N-糖链进行检测,但操作时间长、N-糖链需求量高,需要大量的糖蛋白,在很多情况下难以获取足够的蛋白进行N-糖链的样品制备,特别是对于临床上的微量体液标本、病理切片、穿刺样本等。因此,需要建立低损失的蛋白消化、N-糖链释放和富集的一体化技术,结合快速灵敏的N-糖链分析方法以实现微量糖蛋白N-糖组分析。本研究尝试建立了针对微量样本的N-糖链制备技术(N-Glycan preparation technology,GPAT),用以降低N-糖组学研究的起始蛋白量。通过人免疫球蛋白G(IgG)和人肝癌HepG2细胞蛋白,验证了GPAT对单纯样本和复杂样本N-糖组分析的可行性,并进一步将此方法应用于6例健康人(3例男性,3例女性)的尿蛋白的N-糖组分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker Ultraflex基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(MALDI-TOF MS,美国Bruker公司);离心机和冷冻干燥离心机(美国Thermo公司);微型个人离心机-Multi Spin(日本TOMY公司);JY 92-Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技公司);亲水相互作用色谱填料(HILIC)和反相色谱填料(C18)(天津博纳艾杰尔科技公司)。

IgG标准蛋白、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、氯乙酰氨(CAA)、三氟乙酸(TFA)、肽-N-糖苷(PNGase F)、尿素(UA)(美国Sigma公司);胰蛋白酶(Trypsin,测序级)(美国Promega公司);乙腈(ACN)(美国Merck公司);2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)(美国Bruker公司);Milli-Q去离子水制备系统(美国Millipore公司);其它化学品均为分析纯。

1.2 HepG2细胞培养与蛋白提取

HepG2细胞采用含有10%胎牛血清的高糖培养基(DMEM)在37 ℃、5% CO2环境下培养,待其生长至直径10 cm表面皿的80%时,胰蛋白酶消化回收细胞。然后,使用1×PBS对获得细胞进行3次洗涤去除培养基,再加入1 mL 8 mol/L UA溶解在0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.5)中重悬细胞,然后将其置于超声波细胞粉碎机中进行细胞蛋白提取:超声功率200 W,工作1 s,间隙2 s,共99个循环。提取的蛋白应用Bradford法测定浓度,最后按照所需的量分装,置于-80 ℃冻存备用。

1.3 人尿蛋白的获取

尿液样本来自健康男性和女性各3例(年龄25~30岁),均为空腹晨尿的中段尿,收集至离心管中,于4 ℃下12 000 g离心15 min。取上清液与预冷丙酮混合,于-20 ℃下过夜。将预冷过夜的混合物取出,在4 ℃下2 000 g离心5 min获得蛋白沉淀,加入8 mol/L UA缓冲液复溶蛋白。蛋白用Bradford法测定浓度,最后按照所需的量分装,置于-80 ℃冻存备用。

图1 GPAT样品处理装置和流程Fig.1 GPAT sample processing unit and proceduresreaction chamber A:digestion of proteins,release of N-glycans;reaction chamber B:enrichment of N-glycans

1.4 GPAT的设计及操作

如图1所示,整个装置由反应室A和反应室B组成,其制作成本低,制作时间短,在2~3 min内即可制作完成整个装置。反应室A:在100 μL Tip尖端填一层筛板后引入C18填料,再在填料上方加一层筛板,依次使用纯乙腈、50%ACN+0.1%TFA、0.1%TFA对其活化。反应室A主要用于蛋白的还原、烷基化、酶解、切糖以及N-糖链的分离。反应室B:在200 μL Tip尖端加载一层筛板,然后将HILIC填料引入Tip中,依次使用1%TFA、80%ACN+1%TFA对其活化。反应室B主要用于N-糖链的富集。两个反应室活化过程中均使用Multi Spin除去液体。

GPAT操作流程:取10 μg 溶解于8 mol/L UA的蛋白加入到活化好的反应室A中,同时加入由100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解的TCEP和CAA,终浓度分别为10 mmol/L和15 mmol/L,将其放入37 ℃恒温箱中反应1 h。待反应完成后,加入适量100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)使反应体系中尿素浓度低于2 mol/L,然后按蛋白∶酶=50 μg∶1 μg比例加入Trypsin酶,放入37 ℃恒温箱中消化16 h。反应完成后,按蛋白∶酶=20 μg∶1 U的比例加入PNGase F酶并在 37 ℃恒温箱中切糖2 h。反应完成后,加入TFA使体系终浓度为0.1%,离心收集酶切液。加入和酶切液等体积的0.1%TFA,2 000 g离心1 min,将N-糖链组分洗脱至反应室B中,加入ACN和TFA使反应室B体系变为80%ACN+1%TFA,2 000 g离心 90 s使N-糖链与HILIC结合,加入80%ACN+1%TFA洗脱非糖链物质。最后,加入0.1%TFA洗脱N-糖链,收集组分待测。

1.5 FASP样本制备流程

1.5.2 N-糖链的富集用EP管称取5 mg的HILIC填料,先用0.1%TFA活化填料3次,每次10 min;再用80%ACN+0.2%TFA溶液平衡填料3次,每次10 min。将热干的含有N-糖链的样品复溶于80%ACN+0.2%TFA溶液,并与填料混合,于室温下旋转结合2 h。然后转入到自制富集小柱,3 000 g离心1 min。用80%ACN+0.2%TFA溶液再洗1次去除非特异性结合的杂质,最后用0.1%TFA洗脱3次,得到纯化的N-糖链。参照2018年Zhang等[12]使用的酸法去除N-糖链的唾液酸。

1.6 MALDI-TOF MS分析

采用对MALDI-TOF MS对N-糖链样品进行分析。使用肽校准品(Bruker)进行外部校准,选择2,5-DHB作为基质(用70%ACN+0.1%TFA溶解的1 mmol/L NaCl溶解配制,终浓度为20 mg/mL),使用水溶解N-糖链样本,取1 μL样品点于洁净的不锈钢靶上,待自然干燥后取1 μL基质点靶,待样品与基质自然结晶后推入离子源待测。所有样品的激光强度保持恒定,累加1 500张谱图,采用正离子反射模式对N-糖链进行分析。MALDI-TOF MS数据采用FlexAnalysis 3.3软件进行分析,糖型采用GlycoWorkbench 2.0软件进行分析。

2 结果与讨论

2.1 IgG N-糖组分析

图2 10 μg IgG采用GPAT获得的N-糖链的MALDI-TOF MS谱图Fig.2 10 μg IgG N-glycan MALDI-TOF MS spectra obtained with GPAT the glycoforms corresponding to each molecular weight are labeled;the N-glycan structure simple map display method uses the Consortium for Fuctional Glyomics(CFG) standard to display the graphical rules;the symbols represent the following meanings:“”D-galactose;“”D-mannose;“”N-acetyl-D-glucosamine;“”L-fucose.

在基于质谱的N-糖组分析中,通用的FASP样品制备方案对于蛋白起始量要求很高,而N-糖链释放前蛋白复杂的处理步骤,以及N-糖链富集前对N-糖链的热干、重溶处理,不仅时间长且会造成样品的损失和污染。本研究致力于降低样品制备的蛋白起始量,减少样品制备时间,以满足基于质谱的快速、微量蛋白的N-糖组分析。还原剂TCEP和烷基化剂CAA相容,可以同时使用。因此,选用TCEP和CAA同时加入反应体系中对蛋白进行还原和烷基化处理,以达到简化操作步骤、缩短操作时间的目的。由于GPAT是在离心机上进行,因此可以实现样品的高通量分析。而对于N-糖链的富集,本研究在实验室前期研究结果[13]的基础上进行了优化,使N-糖链洗脱和富集可以实现无缝衔接,减少了常规的N-糖链富集时间和操作步骤,降低了N-糖链的损失。

图3 10 μg HepG2细胞提取蛋白采用GPAT方法制备N-糖链得到的MALDI-TOF MS谱图Fig.3 MALDI-TOF MS spectra of N-glycans prepared by GPAT protocol for 10 μg HepG2 cell extracts R1,R2,and R3 are three replicate experiments,and the glycoforms corresponding to each molecular weight are labeled

IgG是分子量约为150 kDa的糖蛋白,分子为Y型,由两条重链和两条轻链组成,其中重链分为抗原结合区(Fab)和抗体结合区(Fc)。Fc段具有一个N-糖基化修饰位点(含量约为3%~4%),该位点的N-糖链修饰比较保守,因此,使用IgG验证GPAT对于单纯蛋白N-糖链制备的可行性。由于唾液酸易带负电,因此在质谱检测时会抑制N-糖链的信号甚至导致N-糖链无法检出,所以本实验对所有N-糖链进行了酸法去除唾液酸。采用GPAT和FASP方法对分别对IgG进行N-糖组分析。采用GPAT分别对2、5、10、15、20 μg的 IgG进行N-糖组分析,同时采用FASP方法分别对10、15、20、50、100 μg的IgG进行N-糖组分析,得到两种方法的IgG蛋白起始量分别为10、50 μg。如图2所示,采用GPAT对10 μg IgG进行N-糖组分析,获得了20种N-糖链,这与用FASP方法以50 μg IgG为起始量得到的结果一致。由此,在得到相同N-糖组分析结果的基础上,GPAT方法所需要的蛋白起始量更低。

2.2 HepG2细胞提取蛋白的N-糖组分析

N-糖基化修饰在细胞、组织、分泌体系等蛋白中具有重要的功能性作用,因此研究这些蛋白样本的N-糖组分布具有重要的意义。细胞、组织等样本含有多种蛋白,蛋白成分复杂,这些复杂蛋白成分中也含有丰富的N-糖链信息。本研究以8mol/L UA提取人肝癌HepG2细胞系蛋白,并采用GPAT对其进行N-糖组分析。首先,根据“2.1”的实验结果,采用10 μg HepG2细胞提取蛋白进行N-糖链的制备,并进行3次重复实验。如图3所示,3次实验均鉴定到39种N-糖链。对3次重复实验结果两两进行相关性分析,结果如图4所示,其相关系数r2=0.953~0.976,说明方法具有很好的重复性。同时以2、5 μg蛋白为起始量采用GPAT方案制备N-糖链,MALDI-TOF MS分析结果均未得到N-糖链信号。

2.3 健康人尿蛋白N-糖组分析

尿液易于获取,并且可以反映肾脏滤过蛋白质的功能,因此,尿液是公认的疾病诊断、监测和预后评价样本理想来源[13-14]。尿液中可作为疾病诊断标志物的多为微量蛋白,例如,健康人尿中微量白蛋白最低含量为20 μg/mL,因此,常用的FASP方法需要基于大量的尿液样本来获取尿蛋白N-糖链信息。本研究采用GPAT方法,对从6例健康人(3例男性,3例女性)的500 μL尿液里提取的10 μg蛋白进行N-糖链制备。MALDI-TOF MS分析结果如图5所示,在去除唾液酸异质性的基础上,男性和女性尿蛋白均鉴定到了49种N-糖链且结构类型一致。如图6所示,对3例男性和3例女性尿液样本的实验结果进行皮尔森相关性分析,组内分析结果为女性r2=0.938~0.958,男性r2=0.948~0.964,说明组内3次生物学重复有很好的重现性。男性和女性组间皮尔森相关性分析结果的平均r2=0.924。组间相关性小于组内相关性,说明N-糖链的相对丰度在男性和女性之间存在差异。对男性和女性尿蛋白N-糖链进行定量分析,其结果如表1所示。男性和女性尿蛋白N-糖链中存在2种差异糖型,分别为HexNAc(3)Hex(3)和HexNAc(7)Hex(9)(P<0.01)。本实验样品例数较少,进一步加大样品例数后,将有望发现生理病理过程中相关的差异表达糖链信息。

图6 3例男性和3例女性尿蛋白N-糖组分析结果进行皮尔森相关性分析Fig.6 The results of 3 males and 3 females were analyzed by pearson correlation analysis F1,F2 and F3 represent 3 different healthy females,and M1,M2 and M3 represent 3 different healthy males(F1、F2、F3代表3例不同的健康女性,M1、M2、M3代表3例不同的健康男性)

3 结 论

通过GPAT技术对10 μg IgG和10 μg HepG 2细胞提取蛋白进行N-糖组分析,分别鉴定到20种和39种N-糖链,证明了GPAT适用于微量蛋白N-糖组分析。将GPAT技术应用于健康人尿蛋白N-糖组分析,鉴定到49种N-糖链。同时对男性和女性鉴定到的各N-糖链进行差异分析,结果显示HexNAc(3)Hex(3)和HexNAc(7)Hex(9)为差异显著糖型。GPAT技术可以很好地应用于微量蛋白的N-糖组分析,具有操作步骤更少、操作时间更短、样本制备起始蛋白量更低,可以实现样品高通量分析的优点。但GPAT在分析含有唾液酸的N-糖链,适用于各种蛋白溶剂方面依然存在不足,在后续的研究中将进行改善。

表1 尿蛋白N-糖链MALDI-TOF MS相对定量结果Table 1 Relative quantitative results of urinary protein N-glycans by MALDI-TOF MS

Hex(己糖);HexNAc( N-乙酰己糖胺);Fuc(L-岩藻糖)

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