DNA损伤修复相关基因致原发性卵巢功能不全的研究进展

颜圣和，柴雪晨，方舒雨，夏小雨

(上海交通大学医学院临床医学系，上海 200025；2.上海交通大学医学院组织胚胎学与遗传发育学系，上海市生殖医学重点实验室，上海 200025)

近年来，原发性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)发病率逐渐上升，且呈年轻化趋势。POI是一种病因复杂的异质性疾病，约有20%～25%的患者携带遗传突变[1]，另外还可能与病毒感染、代谢异常、自身免疫、医源性及环境等因素相关。通过遗传学研究，已发现多种可能导致POI的染色体异常，例如，以Turner综合征为代表的染色体数目异常，以及POF1区域缺失或POF2区域易位等染色体结构异常。已知与POI相关的候选基因涉及卵巢发育及卵子发生的各个环节，如参与原始生殖细胞迁移和增殖的基因(NANOS3)、调控细胞死亡的基因(PGRMC1和FMR1)、激素和受体(FSHR、AMH、AMHR2)、转化生长因子β超家族(BMP15和GDF9)、染色质及联会复合物结构蛋白(STAG3、SYCE1、SPIDR、NUP107)、转录因子(FIGLA、NOBOX、NR5A1、WT1、FOXL2)、调控线粒体功能的基因(MRPS22、POLG、TWNK、LARS2、HARS2、AARS2、CLPP、LRPPRC)等[2-9]。近年来，随着基因组测序技术、尤其是全外显子组测序(whole exome sequencing，WES)的飞速发展，更多的POI候选基因被发现，其中包含一系列DNA损伤修复相关基因，主要通过调控减数分裂中的同源重组(homologous recombination，HR)过程从而影响卵子发生。本文将介绍卵子发生中的DNA损伤修复机制，并对相关基因与POI发生的最新研究进展作一综述。

一、卵子发生中的DNA损伤修复机制

在减数第一次分裂前期(meiosis prophase I)，同源染色体配对、建立联会复合体(synaptonemal complex，SC)，在此基础上，发生DNA双链断裂(DNA double strand break，DSB)并修复。DSB可引入同源染色体之间的遗传物质交换，增加了基因组多样性，对于物种的适应和进化非常重要。

在减数分裂同源重组过程中，DSB由SPO11蛋白催化形成。在人卵母细胞中，DSB修复持续时间超过四周，主要通过同源重组(HR)途径。在HR途径中，MCM8/MCM9蛋白复合体可以招募MRE11-RAD50-NBS1(简称MRN)复合体至断裂位点，由后者切割形成单链DNA(single strand DNA，ssDNA)，并招募重组酶(recombinase)等下游蛋白。其中，RAD51和DMC1是同源重组途径中重要的重组酶，其功能受许多因素调节，例如，MEIOB/SPATA22蛋白复合物可以稳定RAD51、DMC1与DNA的结合，MND1/PSMC3IP 蛋白复合物可以激发它们的酶活性。在同源重组过程中，重组中间体(recombination intermediates)需要被稳定以促进交叉(crossover)的形成，这个步骤需要例如HFM1和MSH4/MSH5二聚体这一类的解旋酶(helicase)。当交换完成后，同源重组的最后一步是重组交叉结构(double Holliday junctions)的解离，这一过程需要异二聚体MLH1/MLH3的调控与核酸外切酶EXO1的参与。

除同源重组外，非同源末端连接(Nonhomologous end-joining，NHEJ)是DSB修复的第二种机制。已有报道称，参与调控NHEJ机制的基因XRCC4和LIG4的突变可以导致POI及其它一系列表型[10-11]。

另一个重要的DNA修复途径，是Fanconi贫血症(FANC)通路，存在于包括生殖系在内的众多祖细胞中。这条通路涉及至少20种蛋白质，包括FANCA、FANCC、FANCG和FANCM基因的蛋白产物，上述基因的突变有可能导致POI。例如，在2019年，Yang等[12]在散发POI病例中检测到了两种FANCA基因的罕见杂合突变。

二、已知与POI有关的DNA损伤修复相关基因

在POI病例中检出的已知基因突变涉及减数分裂中DNA损伤修复的各个环节，包括DNA单链末端处理、交叉形成、交叉解离等。现将相关基因及突变介绍如下。

1.MCM8和MCM9基因：微小染色体维持复合物组分8(Minichromosome Maintenance Complex Component 8，MCM8)基因位于染色体20p12.3，微小染色体维持复合物组分9(Minichromosome Maintenance Complex Component 9，MCM9)基因位于6q22.31。在体细胞中，MCM蛋白复合体调控DNA复制的起始。而在卵母细胞中，MCM8和MCM9蛋白形成功能复合体，促进同源重组DSB修复的发生。MCM8/MCM9基因突变可能导致配子发生异常和基因组不稳定性。Mcm8敲除雌鼠不育，并易伴发卵巢肿瘤，Mcm9敲除雌鼠同样不育[13]。

已有多项研究报道，在原发性闭经的患者家系中检出了MCM8/9基因的纯合突变[14-17]，患者并伴有高促性腺激素、小卵巢和幼稚子宫、第二性征发育延迟、身材矮小等症状，而杂合突变携带者无表型。该基因的纯合突变同样可对男性性腺发育造成影响，表现为睾丸功能或发育不全、少精症或无精症[18]。

2.DMC1基因：DNA减数分裂重组酶1(DNA meiotic recombinase 1，DMC1)基因位于染色体22q13.1。DMC1蛋白是减数分裂特异性重组酶。在Dmc1缺失雌鼠中，卵子发生在胚胎期卵巢内中止，成熟小鼠卵巢中生殖细胞消失[19]。

Mandon-Pépin等[20]报道，在一例POI女性中发现了DMC1基因的纯合突变。He等[21]报道，在一个中国家系中，在患有POI的女性成员和患有非梗阻性无精症的男性成员中发现了DMC1基因的纯合错义突变。

3.MEIOB基因：MEIOB(meiosis specific with OB-fold)基因位于染色体16p13.3。MEIOB蛋白可结合单链DNA并具有3’-5’核酸外切酶活性。在同源重组过程中，MEIOB与SPATA22蛋白形成复合物，从而稳定重组酶RAD51/DMC1与DSB位点的结合。Meiob敲除的雌、雄两性小鼠均不育[22]。

近期，Caburet等[23]在一对患POI的姐妹中检测出MEIOB基因的纯合突变，突变造成的截断MEIOB蛋白无法与SPATA22蛋白及DSB位点结合。这是第一例有关“单链DNA结合蛋白突变参与POI发生”的报道。

4.MND1基因：减数分裂核分裂蛋白1(meiotic nuclear division 1，MND1)基因位于染色体4q.31.3，其蛋白产物与PSMC3IP蛋白(见下节)形成稳定的异二聚体，通过与PSMC3/TBP1蛋白复合体的相互作用来激活RAD51和DMC1的重组酶活性，在同源重组过程中发挥不可或缺的作用。

Jolly等[24]对42例POI患者进行外显子测序，其中一对姐妹确诊为高促性腺素性功能减退症，在她们的基因组中检测到了MND1基因的纯合缺失突变。

5.PSMC3IP基因：蛋白酶体26S亚基ATP酶3相互作用蛋白(PSMC3 interacting protein，PSMC3IP)基因，又称为HOP2，位于染色体17q21.2。PSMC3IP蛋白与MND1蛋白组成复合体，参与对同源重组的调控。Psmc3ip基因突变雌鼠的卵巢明显缩小，卵泡缺乏[25]。

Zangen等[26]在一个巴勒斯坦家系中鉴定出了PSMC3IP基因的纯合突变，该突变可造成雌激素信号通路的失活。Al-Agha等[27]报道了一个也门的近亲婚配家系，该家庭的4个女儿均患有POI、1个儿子表现为无精症，测序显示这5名患者都存在PSMC3IP基因的纯合突变。上述结果提示PSMC3IP蛋白在生殖细胞发育中发挥重要作用。

6.HFM1基因：减数分裂解旋酶1(helicase family member 1，HFM1)位于染色体lp22.2区域，在睾丸和卵巢中特异性高表达。在减数分裂同源重组过程中，HFM1参与维持重组中间体的稳定，以促进交换的形成。Hfm1敲除雌鼠不育，卵巢小，卵泡减少[28]。

Wang等[29]在两名患POI的姐妹中发现HFM1基因的复合杂合突变(compound heterozygous mutations)，其父母则为表型正常的杂合突变携带者，说明该基因可通过隐性遗传方式致病。此外，在多组对中国散发性POI患者的研究中也发现了HFM1基因的杂合突变[30-31]，进一步提示HFM1基因突变与POI发生之间的关系。

7.MSH4和MSH5基因：DNA错配修复蛋白同源物4(MutS homolog 4，MSH4)基因位于染色体1p31.1，DNA错配修复蛋白同源物5(MutS homolog 5，MSH5)基因位于染色体6p21.33。与HFM1蛋白类似，MSH4/MSH 5异二聚体维持同源重组中间体的稳定。Msh4或Msh5敲除小鼠不育[32-33]。

Carlosama等[34]在一个哥伦比亚POI家系中检测到了MSH4基因的纯合突变。Guo等[35]在一个中国POI家系中检测到了MSH5基因的纯合突变，并在200例散发POI患者中检测到了3种MSH5基因的杂合突变。

8.ERCC6-PGBD3融合基因：切除修复交叉互补基因6(excision repair cross-complementation group 6，ERCC6)与相邻的PGBD3(piggyBac transposable element derived 3)基因位于染色体10q11.23。ERCC6基因又称为科凯恩氏综合征互补组B(Cockayne syndrome complementation group B，CSB)，编码的CSB蛋白可与DNA结合、参与转录偶联的DNA损伤修复，该基因的突变可导致科凯恩氏综合征[36]。PGBD3蛋白功能不明确，可能具有转录调节活性。PGBD3基因可转座插入ERCC6基因，形成ERCC6-PGBD3融合基因，其表达产物ERCC6-PGBD3融合蛋白在卵母细胞核中特异性高表达，可与RNA聚合酶II相互作用，参与转录偶联的DNA损伤修复[37]。

Qin等[37]在432个散发性POI病例和1个包含有4名POI患者的中国家系中，检测到ERCC6-PGBD3融合基因的3种新突变。这3种杂合突变会造成DNA损伤修复机制的招募延迟或缺失，最终导致POI症状，证明CSB-PGBD3融合蛋白在卵子发生中发挥重要作用。

三、结语与展望

POI患者不仅罹受闭经、不孕不育等生殖障碍，而且发生骨质疏松、心血管疾病、抑郁焦虑综合征、自我认知障碍等疾患的风险同样增高，POI患者平均寿命较正常绝经女性缩短，POI严重影响了女性身心健康。目前，尚无公认有效的方法恢复或改善POI患者的卵巢功能，因此，对POI患者的早期发现、早期干预尤为重要，其中，遗传学病因研究是实现高危人群筛查和POI早期诊治的关键之一。

随着以全外显子组测序(WES)为代表的下一代测序技术的快速发展，更多的POI候选基因突变将会被发现。然而，许多研究表明，许多POI患者携带多基因的复合杂合突变；即使在同一家系、相同基因位点的同一突变类型，POI的临床表型也可以因人而异。这些现象说明，候选突变的功能效应与致病机制需经过审慎研究。

在未来有关POI致病突变的研究中，应当纳入更多不同种族、地域的大样本。此外，已经确认的POI突变致病基因、尤其是那些在卵子发生早期发挥作用的基因，是否也与男性生精障碍相关？在确诊相关致病变异/基因后，是否可以利用基因编辑技术改进卵巢机能？综上所述，对POI遗传学发病机制的研究可以深入解析配子发生、生殖功能及不孕不育的分子基础，在为POI患者提供遗传咨询和生育指导方面也同样至关重要。