驴源马腺疫链球菌的分离与鉴定

朱曼玲，齐鹏飞，黄迪海，王长法，张 燕，4，张 伟

（1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南 250100；2.甘肃农业大学，甘肃兰州 730070；3.聊城毛驴高效繁育与生态饲养研究院，山东聊城 252000；4.山东农业科学院生物技术研究中心，山东济南 250100）

腺疫是一种常见的马属动物疫病，是由马链球菌马亚种（Streptococcus equisubsp.equi，S.equi）经口鼻感染后引起的。易感的马属动物可通过直接接触感染，或通过人、物品和环境等媒介间接感染马链球菌[1]。由马链球菌马亚种引起的疾病是世界范围内最常见、最重要的马属动物传染性疾病之一。S.equi具有很强的传染性，引起的发病率可能很高，但导致的死亡率通常较低。S.equi感染的临床症状严重程度，因上呼吸道病症表现而异，多数表现为急性发热并发咽炎，随后下颌和咽后淋巴结形成脓肿，并伴有大量黏液性、脓性鼻分泌物；罕见的潜在致命并发症包括急性呼吸困难、吞咽困难和免疫反应。大多数马属动物感染S.equi后在几周内就会痊愈，然而大约有10%的马属动物会成为慢性的、病菌长期滞留体内的携带者[2]。

目前，关于S.equi感染驴的报道较少。本研究对2019 年5 月发生在山东省某驴养殖场的腺疫疫情进行了S.equi检测和敏感药物筛选，可为驴腺疫的诊断和防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料

无菌采集2头病驴的颌下淋巴结肿胀化脓液。

1.2 主要试剂

营养肉汤琼脂平板、5%绵羊鲜血平板、TSB培养基，2×TaqPCR Master Mix、ddH2O、DL 2 000 bp DNA Master：购自北京天根生化科技有限公司；链球菌生化鉴定试剂盒和链球菌生化编码鉴定手册：购自杭州天和微生物试剂有限公司；EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit：购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 病原菌分离纯化与染色镜检 将无菌采集的脓液，分别划线接种于营养肉汤琼脂平板和5%绵羊鲜血平板，37 ℃培养24 h 后，挑取单菌落进行纯化培养，直到菌落形态稳定一致。挑取单个菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌的形态特征。

1.3.2 生化鉴定 将分离菌接种于链球菌生化鉴定试剂盒，37 ℃培养24 h，然后加入指示剂，观察结果。根据链球菌生化编码鉴定手册进行鉴别分析，认定指数接近100 为可靠结果[3]。

1.3.3 药敏试验 采用纸片扩散K-B 法进行药敏试验：挑取单个菌落接种于5 mL TSB 培养基中，37 ℃培养18 h；用无菌PBS 缓冲液稀释菌液，使其在600 nm 波长的吸光度为0.1；将稀释后的菌液均匀涂布于HM 固体培养基表面，每块培养基贴4 个纸片，37 ℃培养18 h 后，量取抑菌圈直径，重复3 次，计平均值。参照美国临床和实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）药敏结果判定标准（2013 版）进行结果判定。

1.3.4 分离菌16S rDNA PCR 测序（1）PCR模板制备。挑取分离株纯培养单菌落，用TSB培养基增菌后，用EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit 提取菌液DNA。（2）16S rDNA PCR扩增。细菌16S rDNA 的通用引物序列为F27：5'-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3'；R1492：5'-AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3'。欲扩增片段大小约为1 500 bp。上述引物由北京擎科生物科技有限公司合成。反应体系（25 μL）为：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 9 μL，上下游引物（10 mmol/L）各1 μL，模板1.5 μL；反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃变性40 s、56 ℃退火40 s、72 ℃延伸90 s，35 个循环；72 ℃延伸8 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。（3）测序比对分析。将单一目的条带PCR 产物，送华大基因股份有限公司测序，并将测序结果通过Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）在GenBank 中进行比对，用DNAstar 软件构建Blast 比对结果相关基因的系统进化树。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养

从2 只病驴颌下淋巴结肿胀化脓液中分离到2 株菌，分别命名为M1、M2。分离菌为革兰氏染色阳性的弯曲长链条球菌（图1）。2 株菌在营养肉汤琼脂平板上生长不良；在5%绵羊鲜血平板上发生β 型溶血（图2），在露珠状小菌落周围形成完全透明的溶血带；TSB 培养16 h 后，发现试管底有少量菌体，经剧烈摇动才能使培养基混浊。

图1 马链球菌革兰氏染色形态

图2 马链球菌在鲜血平板上发生β 型溶血

2.2 生化鉴定

经生化鉴定，判定M1 和M2 均为马链球菌（认定指数为0.98，尚需鉴别）。生化鉴定结果见表1。

2.3 药物敏感性分析

纸片药敏性试验结果显示，2 株分离菌对12 种抗菌药中的4 种（氨苄西林、卡那霉素、甲氧氨苄嘧啶和四环素）产生了较强的耐药性，但对恩诺沙星、氯霉素、环丙沙星、头孢噻肟和美罗培南高度敏感（表2）。

表1 2 株菌（M1、M2）的生化鉴定结果

表2 2 株菌（M1、M2）的药敏试验结果

2.4 分离菌16S rDNA PCR 扩增分析

分离菌16S rDNA PCR 扩增产物，在1 500 bp左右处出现明显的目的条带（图3）。对该株分离菌进行16S rDNA PCR 测序，并经Blast 比对，发现M1 和M2 分离菌的16S rDNA 序列与S.equi同源性达100%。系统进化树显示，M1 和M2 亲缘关系十分接近（图4）。

3 讨论

本研究从山东省某驴场驴腺疫病例的淋巴结脓液中分离筛选出2 株S.equi菌株。这2 株菌对氨苄西林、卡那霉素、甲氧氨苄嘧啶和四环素产生了不同程度的耐药，对恩诺沙星、氯霉素、环丙沙星、头孢噻肟和美罗培南高度敏感。这表明临床中存在抗生素滥用情况，需要加以控制。因此，当有疾病发生时，需进行快速诊断，根据药物敏感性试验结果，指导临床用药，防止产生药菌株。

图3 2 株菌（M1、M2）16S rDNA PCR 扩增结果

图4 2 株菌（M1、M2）核苷酸序列系统进化树

本研究表明，该次驴疫病是由S.equi感染引起的。在春季，驴易感染S.equi，尤其是幼驹。因此，对此病应根据易感时期、易感季节和病畜症状及时作出判断，以便及时治疗，防止疫病传播，从而减少经济损失[4]。

腺疫是一种细菌感染的马属动物上呼吸道疾病，在世界范围内都有发生，感染的特点是嗜睡、厌食、发烧以及脓性鼻分泌物和周围淋巴结病合并形成脓肿[5]，更严重的并发症包括腺疫转移和免疫反应，如肌病、肾小球肾炎和血管炎等[6-7]。随着驴场规模化养殖程度的不断提升，集约化饲养导致病原滋生泛滥，病原微生物多、密集度高，由此导致感染发病的几率增多。同时在病原的相互作用下，疾病会变得将更为复杂[8]。因此，使用有效的检疫和治疗方法，防止腺疫等传染病的传播，对确保我国驴业的健康发展至关重要。