卡介苗的免疫保护机制及其改造策略进展

杨鲁琦 沈鸣逸 沙巍 陈颖盈 王颖

结核病是慢性呼吸道传染性疾病，以肺结核多见。世界卫生组织[1]《2019年全球结核病报告》估算，2018年全球约有1000万例新发结核病及150万例因结核病死亡的患者，中国结核病负担位列全球第二。此外，有研究估计全球约1/4的人口存在结核感染[2]，提示潜伏感染者体内MTB的再激活可能是结核病防控的更大挑战。

预防性疫苗接种是结核病防控的重要环节。卡介苗(bacille Calmette-Guérin，BCG)作为当今世界上应用了近百年，且唯一获得临床许可的疫苗，已成为结核病高负担国家和地区新生儿强制接种的手段，呈现出一定的保护性。但有研究认为，BCG的抗结核保护时间不长于20年，仅在10岁以下儿童中表现出良好的免疫保护力[3]。故是否在成年人群中再次接种BCG以增强人群的抗结核免疫力成为了研究者关注的重点。现阶段还缺乏重复接种BCG获得有效免疫的证据，因此并不推荐重复接种BCG[4]；但是否可以通过改造BCG来提高其保护效力及时效将是近年来结核病防控领域的关注点之一。目前认为，可以通过在BCG中加载具有良好免疫原性的新结核抗原，或开发不同的疫苗形式(如重组BCG或新型MTB减毒株，或以结核蛋白为主要形式的亚单位疫苗等)来提高新型BCG的免疫保护效力[5]，但要注意人群接种BCG后的免疫状态及接种者是否存在MTB感染史可能给新型BCG的免疫效应带来的影响。笔者将围绕当前BCG免疫保护机制和基于BCG的改造策略进行综述。

一、BCG的抗结核免疫机制及其局限性

BCG是由法国医生Albert Calmette与其助手Camille Guérin在甘油-马铃薯培养基上对牛分枝杆菌历经13年230次传代培养后分离获得的减毒株[6]。自1921年第一次接种于新生儿后，BCG开始在全球范围内广泛应用。1933年，王良将BCG引入中国并在小范围内实施接种，后于1979年在全国范围内实施强制接种[7]。目前，BCG在我国的新生儿接种率达到99%，产生的保护力不仅能有效降低婴儿罹患结核性脑膜炎和粟粒性肺结核的风险[8]，还能对抗其他感染性病原体(如呼吸道病毒等)的入侵，有效降低新生儿出生后1年内的死亡率[9]。

(一)抗结核免疫机制

BCG能够编码4000多种蛋白，抗原谱丰富，接种后可在机体内引起丰富的免疫应答反应。研究显示，疫苗接种1～3 d后，BCG可诱导接种部位的固有免疫细胞在接种部位产生局部炎性细胞因子[如白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等]，并可招募单核细胞到达接种部位；9 d后，局部浸润的单核细胞成为炎性因子的主要来源[10]。BCG的病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP；如肽聚糖、阿拉伯半乳聚糖和霉菌酸等)存在于BCG菌株的细胞壁中，可通过与固有免疫细胞表面的病原识别受体[pathogen recognition receptor，PRR；如补体受体、Toll样受体(TLR)-2和TLR-4等]作用而启动免疫应答[11]。随后，疫苗接种部位的树突状细胞携带BCG抗原进入淋巴结，向初始T细胞递呈BCG抗原，启动适应性免疫应答。此外，被吞噬进入单核-巨噬细胞内的BCG还可通过细胞内模式识别受体——核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(nucleotide-binding oligomerization domain-2，NOD2)受体介导的信号通路使其发生表观遗传修饰，最终导致细胞功能的改变[12]。

BCG主要诱导人体内产生辅助性T细胞1(Th1)。同时树突状细胞发挥其抗原交叉呈递功能，引起CD8+T淋巴细胞免疫应答[13]。虽然目前普遍认为BCG引发的免疫应答以细胞免疫为主，但BCG接种者血清中可以检测到MTB脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)特异性IgG水平显著增加[14]，且LAM的糖成分——阿拉伯甘露糖(AM)的单克隆抗体在研究中显示出保护作用[15]，因此推测体液免疫也可能在BCG诱导的免疫保护中同样具有一定的意义。

(二)BCG保护力的局限性

尽管已有的研究结果显示，接种BCG可以通过产生有效的固有免疫应答和适应性免疫应答介导抗MTB的免疫保护作用，但是BCG对抗结核感染的保护力仍存在以下4个方面的不足。

1.BCG菌株间保护力差异：世界卫生组织[16]认为，不同国家之间BCG的抗结核保护效力存在差别，但原因尚不明朗。目前，已在动物模型中完成比较共4类13株BCG亚株，结果发现不同BCG亚株的保护力存在差异：其中BCG-Phipps 株、BCG-Frappier株、BCG-Pasteur株和BCG-Tice株等BCG菌株(属于DU2-Ⅳ组)的保护力较强，而包括BCG-Sweden株和BCG-Birkhaug株在内的DU2-Ⅱ组BCG菌株保护力相对较弱[17]。因此有人推测，BCG保护力在各国间出现差异是由于长期培养和传代导致不同国家应用的BCG菌株间产生了基因多态性，包括序列的重复、缺失和单核苷酸多样性。

2.BCG保护力的时效性：虽然有研究显示，BCG免疫能够在某些人群中表现出20年或者更长时间的保护效力，但明显增加的20岁以上结核病患者的数量，则提示BCG可能无法提供长效保护[18]，可能是以下多种免疫学因素共同造成的。

1)免疫记忆 T 细胞数量不足：任何一种预防性疫苗接种后保护力的维持都依赖于免疫记忆功能。BCG诱导的保护性免疫应答主要由T细胞介导，因此特异性记忆性T细胞(memory T cells，TM)的持续存在和功能维持对于抗结核保护至关重要。其中，当中央记忆性T细胞(central memory T cells，TCM)再次受到抗原刺激时能迅速分化成效应T细胞(effector T cells，TE)而参与再次应答，对免疫保护的长期维持意义更大[19]。然而目前的研究结果显示，BCG在成年人外周诱导产生的免疫记忆T细胞以效应记忆性T 细胞(effector memory T cells，TEM)为主，而TCM细胞数量偏少，这可能是BCG保护力存在时效性的重要原因[20]。

2)免疫记忆T 细胞耗竭：在结核病高发地区，影响BCG保护力减弱的因素也许不仅局限于TCM细胞产生数量的降低，长期接触结核抗原导致TM细胞消耗或T细胞功能受损也可能是另一重要原因[20]。由于接触结核抗原的概率高于其他地区，高发地区接种者体内结核抗原特异性TM细胞可能频繁地产生应答，缓慢消耗抗结核特异性TM细胞池，最终导致BCG保护力持久性减弱[21]。同时，可观察到患者体内TE表面程序性死亡配体-1(PD-L1)和PD-L2分子的表达上调，提示频繁暴露于MTB高负担环境下，不仅持续消耗TM细胞，也会不断抑制T细胞免疫功能[22]。

3)Th17细胞数量减少：有研究报道，BCG在肺脏局部诱导产生的Th17细胞的含量与BCG的保护效力呈正相关[23]。但随着接种时间的延长，Th17细胞的衰减可能导致BCG保护效力降低。

4)定植记忆性T细胞的衰减：由于MTB通过呼吸道感染，肺部定植记忆性T细胞(resident memory T cells，TRM)在抗结核免疫应答中位居一线，发挥的抗结核保护作用也日益受到关注[24]。然而，目前尚未见关于BCG皮内接种后肺脏局部TRM长期维持高水平的报道，其衰减亦可能导致BCG保护力具有时效性。

5)BCG 活菌在体内的存活时间：结核特异性T细胞对抗原的应答水平与BCG活菌的体内持留具有较强的关联性，可能在一定程度上影响着BCG保护力的持续性。当小鼠体内BCG活菌被清除，其诱导的免疫应答水平亦会呈现逐渐减弱的趋势[25]，其在接种部位的存活时间可能仅为4周左右[26]，尚未见BCG更长时间在胞内持留的相关报道。

3.注射途径的影响：当前，BCG主要通过皮内接种，其他的接种方式也在不断尝试中。在最新非人灵长类模型中发现，静脉注射BCG能极大地提高其保护力[27]。然而，由于BCG是一种活菌疫苗，静脉接种是否会造成BCG在血液中的留存或播散，以及是否会导致被接种者形成新的感染，是静脉接种面临的最大的安全性挑战。同时，也有学者提出通过鼻腔吸入BCG进行免疫[28]，其安全性和免疫保护作用也需要进一步实验证明[29]。这些研究在未来能否在人群中应用目前还很难判断，但均为BCG的作用机制研究和新的接种途径提供了重要方向。

4.基础疾病和其他因素的影响：接种者自身的基础疾病和其他因素也对BCG的保护效力产生不可忽视的影响。如HIV感染、糖尿病、恶性肿瘤等疾病，以及空气污染和低体质量指数(BMI)都可能削弱BCG的保护力[30-31]。当BCG接种者感染HIV后，其体内CD4+T淋巴细胞的数量和功能会逐渐降低，导致BCG免疫应答下降、保护力降低，成为结核病发病的重要诱因，也是目前MTB与HIV双重感染防控的难点。

二、基于BCG的疫苗改造策略

来自世界卫生组织[3]的报告指出，BCG不能为全人群，特别是成年人提供足够的抗结核免疫保护，新型抗结核疫苗的研发将成为结核病防控中的核心科学问题之一。新型抗结核疫苗的形式主要包含重组 BCG(rBCG)和亚单位疫苗。rBCG的优点在于其包含更广谱的抗原且与自然结核感染有一定相似性。而亚单位疫苗仅含有MTB的部分抗原，具有安全、保护力良好的优点[31]，但如果作为初次免疫疫苗，其保护效果很可能弱于现有的BCG，可能更适用于BCG初次免疫后的加强免疫[5]。故在新型抗结核疫苗研发过程中，以BCG为基础的基因工程改造策略成为主要研究目标，主要包含两种：其一是改造BCG使其表达不同的结核抗原，提高改造后BCG的抗原多样性和免疫原性；其二是通过改造BCG进一步增强宿主对其抗原的提呈能力[32]。

(一)增加现有BCG菌株的抗原多样性

采用基因工程技术，在现有BCG菌株中加入MTB不同感染状态下表达的特异性抗原，以增加BCG的抗原多样性，继而增强其诱导的抗结核免疫应答，是目前最为常用的改造策略。

1. 利用MTB复合群基因组与BCG的差异。与MTB相比，BCG全基因组缺失16个基因差异区域(region of differences，RD)[33]。这为改造BCG提供了重要的思路，即将RD区的部分基因整合到BCG中，构建可表达相应抗原的rBCG，有望提高疫苗对结核感染的特异性免疫保护力。

RD1在MTB致病过程中起着关键的作用。其表达的早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)作为MTB特异性抗原，已在结核病的免疫学诊断中得到广泛应用。小鼠实验结果显示，将ESAT-6与双十八烷基二甲基溴化铵(DDA)/单磷酰脂质体A(MPL)佐剂共同免疫小鼠后，可诱导产生ESAT-6的特异性T细胞反应，其对结核感染的保护力与BCG免疫相当[34]。目前已尝试在BCG菌株原有的基因序列中加入RD1区，形成新菌株BCG∶∶RD1，在动物模型中可观察到保护力的提高；然而，对免疫缺陷小鼠行静脉注射BCG∶∶RD1后，小鼠肺、脾脏的菌载量为BCG母株的100～1000倍，且易诱发脾肿大和肉芽肿，可见BCG经此改造后毒力被增强[35]。这可能与用于重组的MTB抗原诱导的免疫应答能力过强有关。RD2仅在部分BCG菌株中存在，其编码的MPT64蛋白可在结核感染者体内诱发迟发型超敏反应[36]。

2. BCG中存在过表达强免疫原性的保护性抗原也是目前增加BCG抗原多样性的策略之一。Ag85家族是目前rBCG 构建中最常用的抗原，包含Ag85A、Ag85B和Ag85C 3个蛋白，是MTB生长过程中主要的分泌型蛋白。过表达Ag85A的rBCG可使小鼠脾脏细胞分泌的γ-干扰素(IFN-γ)水平上升，且可诱导强IgG2a抗体反应[37]。此外，脂蛋白家族中也存在具有强免疫原性的蛋白，如可在活动性结核病患者外周血中检测到高免疫反应性脂蛋白Z(LppZ；由Rv3006基因编码)，其免疫小鼠后，可诱导产生和BCG免疫相当的抗MTB免疫保护作用[38]，有望成为未来构建rBCG的新型候选抗原；其他如PstS3、Mpt83、RpfB等脂蛋白抗原均呈现出良好的免疫原性，亦可成为构建rBCG的重要候选抗原[39]。

(二)以增强宿主抗原提呈能力为目标的改造策略

德国马普所Kauffmann教授课题组尝试不同的rBCG构建策略。由于MTB中脲酶C可抑制吞噬体的酸化作用，阻碍吞噬体成熟，进而导致主要组织相容性复合体(MHC Ⅱ)分子表达和抗原提呈减少，使宿主免疫系统不能很好地发挥免疫学功效[40]。而李斯特菌的穿孔素O(LLO)则有利于吞噬体和溶酶体融合，可帮助细菌逃逸到被感染细胞的细胞质中，促进干扰素诱导黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)蛋白炎症小体的激活、增强细胞自噬和凋亡。故Kauffmann课题组将原BCG中的脲酶C替换成穿孔素O，构建了具有更好免疫保护力的新型结核病疫苗——VPM1002[41]。VPM1002临床Ⅰ期试验开展于2008年，结果显示，在接种人群中除了具有良好的安全性以外，还展现出较好的免疫原性，可诱导IFN-γ阳性的 T细胞和特异性抗体的产生[42]。继而研究者在结核病高发地区的新生儿中进行临床Ⅱ期试验，进一步评估VPM1002的安全性。结果显示，BCG和VPM1002均可诱导IL-17的免疫应答，且VPM1002的受接种者注射部位脓肿形成的占比低于BCG，进一步证实了VPM1002的安全性、耐受性和免疫原性[43]。目前，VPM1002正在开展临床Ⅲ期试验。

全球结核病疫苗基金会也采用过类似的策略开展BCG改造试验。他们将原有BCG中的脲酶C替换为产气荚膜梭菌溶素O(Pfo)构建rBCG菌株——AERAS-401，其在重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中表现出良好的耐受性和安全性；第二代rBCG菌株——AERAS-422在动物实验中也显示出具有抗原多样性及增强抗原提呈能力的特点，且优于BCG的免疫原性和免疫保护性[44]。但在人体临床试验Ⅰ期的受试者中有2名出现了水痘带状疱疹病毒的再激活，导致该疫苗的开发被中断[45]。

三、rBCG的免疫策略

目前，rBCG的免疫策略理论上包括以新生儿为接种对象的rBCG初次免疫疫苗和用于BCG初次免疫地区的加强免疫用rBCG疫苗。笔者上面提及的两种BCG改造策略，不论是增加结核抗原的多样性还是增强宿主的免疫应答水平，构建出的rBCG均可作为初次免疫用疫苗。然而，我国作为结核病高负担国家，BCG第一针接种通常在婴儿出生后24～96 h内完成，而这个时间也是新生儿发生与疫苗接种无关的死亡或接种后异常反应的高发时期，如果将改造后的rBCG疫苗用于新生儿的初次免疫，要求监护人签知情同意的可能性极低，处理偶合反应后的不良事件也会极其困难，故rBCG用于新生儿初次免疫的可能性几乎为“0”[46]。所以，“BCG初免-rBCG再免”这一免疫策略成为现阶段rBCG 可在我国临床应用的唯一共识。

四、新型BCG疫苗研究的展望

尽管目前对于BCG接种后的免疫保护机制有所了解，并已经提出一些BCG重组改造策略，但仍有很多有待解决的问题。

1．如何选择构建rBCG的基础BCG菌株是目前面临的问题之一。目前，对13株BCG菌株的全基因组进行解析后发现，不同BCG菌株的缺失基因在数量和种类上不尽相同。因此，深入探索不同菌株间保护力的差异和缺失基因间差异的关系，不仅对BCG菌株的选择具有重要意义，也可为后续这些菌株的免疫原性和可能存在的免疫病理性提供更多的实验数据支持。

2. 选择新的结核抗原也是BCG改造的重要部分。目前，构建rBCG常用的抗原主要集中在Ag85家族，但是该家族分子所诱导的免疫保护作用亟待进一步的实验结果支持。同时，由于MTB在不同感染状态下的基因表达谱不尽相同，因此选择其在潜伏感染、早期感染和(或)晚期感染状态下的特征性抗原用于构建rBCG，有望实现对不同人群的全面保护。但免疫原性过强的蛋白(如ESAT-6)会导致免疫病理的发生，并不是理想的候选抗原。因此，用于重组的结核抗原的免疫原性强度也将成为抗原选择的另一个重要标准。

3. 对于构建成功的rBCG，选择接种人群也是另一个关键问题。由于各方面原因，当前在我国使用rBCG取代BCG可行性较低。但是否能够在BCG免疫过的青少年或成年人中使用rBCG以延长抗结核保护力时间、降低人群MTB感染率，或是将构建成功的rBCG作为治疗性疫苗，亦或是构建出具有足够安全性的rBCG用于潜伏性结核感染人群，都将是研究者未来努力的方向[47-48]。

笔者在前期的研究中发现，不同年龄段的结核感染T淋巴细胞斑点试验(T-SPOT.TB)检测阴性人群对于存在于BCG中的不同结核抗原的响应强度和免疫应答能力不尽相同(待发表)；因此推测，不同年龄段人群对于加强抗结核免疫用抗原的需求也可能不同。而从需要接种的人群来看，结核病密切接触者及参与其诊疗过程的医务人员是实施再接种的首选人群；而结核病高发年龄段(15～25岁)人群也可成为潜在接种人群。因此，在考虑加强疫苗免疫前是否可以先对健康人群按年龄段或者其他指标初步筛选接种人群，利于实现特殊人群精准再免疫，发挥更有效的免疫保护作用。对于上述研究，值得做进一步探讨。

4. BCG接种的驯化免疫(trained immunity)作用。有研究报道，婴幼儿接种BCG后可以明显降低其他病原体感染造成的死亡率，这可能与驯化免疫相关，即固有免疫细胞在适当的病原体刺激下可以通过表观遗传机制产生类免疫记忆样功能，从而整体提高机体对其他病原体的免疫功能[49]。在最近发生的新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)疫情中，有研究显示各国COVID-19发病率与其BCG接种率呈负相关[50]。虽然这项研究仅局限于两者之间存在相关性而非因果关系，但也可能再一次说明BCG接种后驯化免疫带来的免疫保护。但在接种BCG的人群中，这种驯化免疫功能可以维持多长时间、在rBCG免疫后驯化免疫是否可以和T细胞协同发挥更好的保护作用，以及BCG接种后带来的驯化免疫能否对COVIID-19有防治作用，均是未来值得做进一步探索的前沿问题。

综上所述，关于BCG的免疫保护力及其改造策略的研究仍然具有很多未解决的科学问题，对其进行深入的探索将推动结核病防治的发展。