甘蔗赤条病及其病原生物学研究进展

2020-01-08 22:16储娜孙会东周敬如傅华英李晓燕高三基
中国糖料 2020年1期
关键词:亚种燕麦甘蔗

储娜,孙会东,周敬如,傅华英,李晓燕,高三基

(福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心,福州 350002)

0 引言

甘蔗(Saccharumspp.)是中国乃至全球重要的糖料作物,甘蔗糖分别占我国和全球食糖总量的90%[1]和80%[2]。甘蔗除了制糖,还可以生产燃料乙醇、制作青贮饲料,制糖副产品还可以进行高值化、资源化为目的的多元化利用。甘蔗病害种类至少有130 多种,我国有记载的病害至少50 余种[3]。甘蔗细菌性病害主要有由燕麦食酸菌燕麦亚种[Acidovorax avenuesubsp.avenae(Aaa)]引起的赤条病,由木质部赖氏菌木质部亚种(Leifsonia xylisubsp.xyli)引起的宿根矮化病,由白条黄单胞杆菌(Xanthomonas albilineans)引起的白条病和由地毯草流胶病黄单胞杆菌(X.vasicolapv.vasculorum)引起的流胶病[4-5]。其中,甘蔗赤条病是一种全球普遍发生的病害,其叶条斑型对甘蔗生产不会造成严重影响,但是该病害顶腐型会引起植株死亡,对甘蔗及其蔗糖产业造成严重损失。本文拟从甘蔗赤条病基本情况及其致病菌的生物学基本特性和分子生物学基础研究等方面内容进行综述,并对该病害的生态防控和今后的研究重点进行探讨,以期为甘蔗赤条病的有效防控提供参考。

1 甘蔗赤条病基本情况

1.1 病害发生与危害

早在1895 年阿根廷报道的一种众所周知的“Polvillo”病害,可能是甘蔗赤条病。上世纪20 年代美国夏威夷将这种病害症状描述为红色条斑,命名为细菌性红色条斑病,其病菌最早于1925年由Lee和Martin分离获得,并通过接种鉴定证实[6]。该病害在澳大利亚、美国、古巴、阿根廷、巴基斯坦等50 多个国家或地区均有发生[7]。近年来,该病害在阿根廷蔗区暴发,造成甘蔗经济损失30%[4]。上世纪80 年代在我国广东、广西、福建、海南、台湾等省份也有甘蔗赤条病发生,有的蔗区田间自然发病率高达到60%[8]。最近,云南省元江县蔗区也出现了甘蔗赤条病[9]。我国蔗区赤条病几乎每年都有发生,引起甘蔗减产、品质下降[10]。

1.2 病害典型症状

甘蔗赤条病的症状有两种类型:叶条斑和顶腐,两者可以单独发生,也可同时发生[6-8]。叶条斑型:症状一般多发生于嫩叶叶片中部,靠近中脉部位,最初表现为水渍状褪绿条纹,随后向两端迅速扩展成长条状红色至红褐色病斑。叶片条斑的发病组织与健康组织有明显的界限,宽度为0.5~4 mm,长几十毫米至叶片全长。有时2条或多条条斑连接成带状,某些品种可延伸至叶鞘。在叶片下表皮病斑上,常常可见到一层薄薄粉末状的细菌溢出物。在寒冷干燥的条件下,条斑的边缘具有黄晕,以后条斑彼此组合成赤条与黄晕相间的宽带。顶腐型:植株表现为老叶黄化、枯萎,其早期症状是甘蔗生长点附近的维管束变红、腐烂,进一步发展,导致节间大腔穴的形成,后期心叶腐烂,可以从外面包着的叶鞘中拉出来,并具有一种特殊的难闻臭味。严重发病的顶腐型植株蔗茎内部组织从上往下腐烂,直至基部,甘蔗生长受到抑制,一般枯死。有时植株蔗茎最上部的一些芽会长出侧枝,这些侧枝上的叶片可能表现出叶条斑型的症状。严重发病的蔗茎,芽一般发生腐烂,即使没有腐烂,蔗种长出的幼苗也容易死亡[8]。

1.3 寄主范围

燕麦食酸菌属细菌能侵染许多重要的单子叶和双子叶植物[11-12]。燕麦食酸菌燕麦亚种属于食酸菌属(Acidovorax)的一个亚种,其自然寄主范围有甘蔗、高粱、玉米、燕麦、黍和狐尾草等一些禾本科植物[6],此外,还有水稻[13]、大鹤望兰(Strelitzia nicolai)[14]、匍匐翦股颖(Agrostis stoloniferaL.)[11]和美人蕉(Cannasp.)[15]。食酸菌属还有两个亚种,即燕麦食酸菌西瓜亚种(A.avenuesubsp.citrulli),主要侵染西瓜和葫芦科植物;燕麦食酸菌卡特兰亚种(A.avenuesubsp.cattleyae),只侵染卡特兰和蝴蝶兰[12]。

1.4 传播途径与病害循环

甘蔗赤条病在田间主要靠风、雨传播,通过蔗种、机械途径传播的可能性很小,昆虫可传播病菌,但不是主要的传播媒介[6,8]。在潮湿温暖的条件下容易发病,一般5~7 d 便可产生典型症状。甘蔗赤条病病原菌从叶片上、下表皮的气孔和伤痕处侵入,并在入口处薄壁组织的细胞间隙大量繁殖,然后侵入维管束中的各组织,特别是导管更容易充满病菌,并在导管中纵向蔓延。病叶的伤痕表面常有细菌溢泌物,可借助雨水和气流,在植株个体间、田块间传播。在病害侵染循环中,田间带病菌的残叶或者中间寄主杂草是病害的初侵染源。病原菌可以在土壤中存活32 d,在患病的枯老蔗叶、蔗茎中经4个月后仍然有致病力[8]。

2 病原菌生物学基本特性

2.1 病原菌分类地位

甘蔗赤条病最开始被认为是由红条纹假单胞菌(Pseudomonas rubrilineansStapp)引起[6],随后,Willems等[16]将它重新命名为食酸菌属(Acidovorax)燕麦食酸菌燕麦亚种。食酸菌属(Acidovorax)最早由Willems等[17]提出,他根据细菌的DNA/rRNA 和DNA/DNA 杂交、生化指标、生长培养特性、脂肪酸图谱以及全细胞蛋白质聚丙酰胺凝胶电泳等结果,将假单胞菌属(Pseudomonass)的敏捷假单胞菌(P.facilis)和德氏假单胞菌(P.delafieldii)以及一些假单胞菌属和产碱杆菌属(Alcaligenes)等株系分出另立为食酸菌属,包括了敏捷食酸菌(A.facilis)、德氏食酸菌(A.delafieldii)和中等(温和)食酸菌(A.temperans)。随后,Willems 等人[16]还将假单胞菌燕麦假单胞菌(P.avenae)和魔芋假单胞菌(P.konjaci)移入食酸菌属,分别称为燕麦食酸菌种和魔芋食酸菌(A.konjaci),同时,提出燕麦食酸菌种包括燕麦食酸菌燕麦亚种、燕麦食酸菌卡特莱亚种和燕麦食酸菌西瓜亚种。然而,Schaad等[18]对该属提出修订,建议将燕麦食酸菌卡特莱亚种和燕麦食酸菌西瓜亚种应该定义为细菌种,并增加水稻食酸菌(A.oryzae)为一个新的进化分支。

根据2015 年Wiley 出版社和伯杰氏手册基金会联合出版的《伯杰古细菌和细菌分类手册》描述,食酸菌属包含7 个种和3 个亚种,代表种为敏捷食酸菌。根据食酸菌属进化分类地位可以分为两组,一组包含敏捷食酸菌、德氏食酸菌、德弗食酸菌(A.defluvii)和中等食酸菌,这些存在于土壤、水和临床的分离物中;另一组包括对植物有致病力的燕麦食酸菌、魔芋食酸菌和花烛食酸菌(A.anthurii)[12]。

2.2 病原菌形态特征及生长条件

燕麦食酸菌燕麦亚种属于革兰氏阴性菌,在牛肉汁葡萄糖琼脂培养基上,单菌落形态呈现圆形、半透明、浅黄色,菌落直径大小约2~3 mm;菌落低凸、湿润光滑、边缘缨边形或圆锯齿状[6]。该菌细胞形态为短杆状,末端圆钝,1.60µm×0.70µm,具有单极鞭毛,偶尔有2~3 根单极鞭毛,能游动,单生,偶有串成链状,不形成芽孢,无隔膜[6]。在30℃的培养条件下,第3天菌落直径达到0.5~3 mm,第7天菌落直径达到4 mm。燕麦食酸菌大多数菌种在营养琼脂上不产生色素,但是一些植物病原菌株可以产生黄色至微褐色的可扩散性色素[16,19]。在培养基上,此菌的生长温度范围为30℃~35℃[12],致死温度为51℃~52℃[8]。

2.3 甘蔗赤条病菌基因组特性

目前,美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库公布的燕麦食酸菌燕麦亚种基因组序列共有18条,其中模式菌株ATCC 19860 具有完成图,另外17 个株系基因组仅为框架图或精细图[20-22],以上这些菌株的基因组序列大小为5.48~5.75 Mb,GC 含量为59.9%~68.8%,预测编码基因有2 659~5 118 个,已注释蛋白为2 542~4 706个。Fontana等[21]对侵染甘蔗的燕麦食酸菌燕麦亚种菌株T10_61进行了基因组测序和序列分析,结果显示基因组序列为有5.65 Mb,GC含量为68.7%,编码大约5 096 个基因,已注释蛋白为4 829个,编码58个tRNA;该菌株染色体上有3个rRNA操纵子和43个tRNA。

3 病原鉴定与检测

通过田间症状来诊断甘蔗赤条病容易造成误诊,因为由红苍白草螺菌(Herbaspirillum rubrisubalbicans)[23]、黄单胞杆菌(Xanthomonassp.)[4,24]、链格孢菌(Alternariasp.)[25]也会引起甘蔗叶片出现红色或红褐色的条纹,类似甘蔗赤条病叶条斑症状。病害诊断还可以通过病原形态电镜观察、生化测试、血清学反应以及多种分子检测方法。常规PCR、巢式PCR、荧光定量PCR 等技术已应用于该病害检测。Zia-ul-Hussnain 等[26]从巴基斯坦甘蔗赤条病病株上分离得到了Aaa病菌,并分析了该病菌的菌体形态、培养条件和生理生化特性。Song 等[27]建立病菌生物学培养和巢式PCR 相结合的BIO-PCR 方法,对64 份水稻种子Aaa病菌进行检测,比常规PCR 检出率高出29.7%。Fontana 等[4]利用靶向燕麦食酸菌的ITS 区域引物(Oaf1 和Oar1)和靶向细菌16S rRNA 通用引物(Plb/Mlb和P0f/P6r)对甘蔗赤条病样品进行常规PCR检测。我们课题组根据燕麦食酸菌燕麦亚种ITS区域设计一套巢式检测引物对国内甘蔗赤条病样品也开展病害Aaa检测[28],随后,利用内测引物(RSD-ITS-F1 和RSD-ITS-R1)对84份有疑似赤条病症状的样品和24份无症状的样品分别进行常规PCR 检测,检出率为96%和83%[1]。此外,还开发了一套TaqMan 探针实时荧光定量PCR 快速、准确、灵敏的检测方法,检测灵敏度达100 拷贝[29]。有关环介导等温扩增反应(LAMP)检测技术在甘蔗赤条病上的应用未见报道[30]。

4 病原菌遗传变异

关于侵染甘蔗的Aaa遗传多样性研究报道较少。Fontana 等[4]利用RAPD-PCR 技术分析了39 个来自阿根廷的甘蔗赤条病菌的遗传多样性,结果发现这些分离物具有丰富的DNA 多态性图谱,可分成4 种不同的类群,与分离物的地理来源有一定的相关性。最近,Fontana 等人[31]采用多位点序列分型技术(Multilocus sequence typing,MLST)进一步研究阿根廷甘蔗赤条病菌的遗传多样性,来自4 个阿根廷蔗区的15 种株系存在5种核苷酸序列类型。基于142条甘蔗赤条病菌的ITS间隔区序列分析发现,我国蔗区甘蔗赤条病菌株系序列存在高度的遗传多样性,ITS 间隔区序列长度存在明显的差异,主要是由于不同的插入/缺失(InDel)所致;这些分离物序列存在7种类型[1]。

5 燕麦食酸菌致病机理

目前有关于燕麦食酸菌种的致病机理研究报道较少,国内学者对水稻细菌性褐条病的病原菌水稻食酸菌致病机理有了系统研究。Liu 等[32]通过蛋白质谱分析并结合生物信息学方法,探究水稻食酸菌RS-1 株系的致病机理,结果发现了病原菌的Ⅳ型分泌系统结构影响其致病性。刘贺[33]进一步研究该病原菌的Ⅳ型分泌系统中的某些基因功能,发现icFm和dotU基因的缺失突变会导致水稻食酸菌RS-1 株系致病能力大大下降,而且icFm和dotU之间存在相互作用;另外,还发现病原菌菌毛中的重要基因pilp在其致病性、游动能力、菌毛形成和生物膜形成等方面也发挥重要作用。当pilp基因缺失后,细菌丧失菌圈和Ⅳ型菌毛,但是,当该基因回补到突变菌体时,细菌再次形成晕圈,再次长出菌毛。Masum 等[34]通过基因片段插入、缺失和互补分析方法研究Ⅵ型分泌系统(T6SS)对水稻食酸菌RS-2株系的致病性,并使用同源重组法构建25 个T6SS突变体与野生型(RS-2)之间进行毒力比较,结果显示,有15个T6SS基因突变体显著降低了细菌的毒力以及减少了HCP 蛋白的分泌,表明T6SS 在菌株RS-2 的毒力中起着重要作用,主要原因可能是由于HCP 蛋白分泌减少和生物膜的形成等因素导致。

Brigida 等[35]基于转录组水平分析甘蔗响应Aaa的分子机制,结果表明,在受Aaa侵染的转录本中,共有789 个不同的转录本,其中有723 个被注释,对应467 个基因;将获得的差异基因通过GO 和KEGG 富集分析显示这些基因参与了几种代谢途径,如蛋白质编码的应激反应、碳水化合物的代谢、蛋白质的转录和翻译过程、氨基酸代谢和次生代谢产物的生物合成等;同时,在ET 和JA-PRR 生物合成途径中的基因、氧化爆裂基因、NBS-LRR基因、细胞壁强化基因、SAR诱导基因和致病相关基因(PR)显著上调,因此这些基因都有可能积极参与甘蔗响应Aaa侵染的防御作用。

6 甘蔗赤条病防控技术

选育和推广甘蔗抗病品种是甘蔗赤条病防控最经济、最有效的措施,也是一种绿色生态防控技术[6-8]。我国蔗区目前种植的甘蔗品种新台糖16 号、新台糖25 号、粤糖93-159、粤糖00-236、桂糖94-116、桂引5 号、云蔗03-194 在自然条件下有发病的现象,但是他们的抗病性需要进一步接种鉴定[9,36],通过田间的调查研究以及赤条病的接种实验发现云蔗03-194 和闽糖11-610 为感病品种,福农38、福农39、桂糖29、桂糖31、粤糖60、粤糖55、云蔗05-51、柳城05-136、新台糖20号、新台糖22号等为抗病品种。

另外,还要采取多种农业防治措施进行综合防控甘蔗赤条病。如:搞好农田基本建设,建立合理的排灌系统;及时清除蔗田病株病叶,最好堆肥或集中烧毁,减少病害侵染源;适当增施磷、钾肥,促使植株健壮,增强抗病能力,降低发病率。化学药剂防治也是有效控制甘蔗赤条病发生和流行的重要技术措施。在甘蔗赤条病发病初期,可用72%农用链霉素可湿性粉剂750~1 000倍液或50%代森锌1 000 倍稀释液喷雾,每周一次,连续喷2~3次[36]。

7 展望

甘蔗是我国主要的糖料作物,是影响我国国计民生的四大农产品之一,广西和云南1 Mhm2(1 500 万亩)蔗区已列入国家重要农产品生产保护区[37]。目前我国甘蔗赤条病在国内各主要蔗区有零星发生,个别种植感病品种的田块发生率较高,该病害的综合防控应该引起重视。加快甘蔗抗病育种的进程,选育高产高糖抗病甘蔗新品种,为蔗区甘蔗品种多系布局提供依据;加强甘蔗野生种质抗性基因的挖掘,拓宽国内的甘蔗亲本杂交遗传基础,通过有性杂交导入抗性遗传物质也值得深入探索。有报道甘蔗印度种、中国种种质材料比较抗病[1,8]。虽然近年来有关甘蔗赤条病的病原分离鉴定、分子检测以及致病菌的遗传多样性已有报道,但是有关甘蔗赤条病菌的致病机理及其与寄主的分子互作机制尚不清楚。随着基因组测序技术的快速发展,容易获得细菌全基因组的序列信息,可以在结构基因组学、比较基因组学层面上,通过生信分析技术和手段探究细菌的耐药性、毒力因子、代谢系统、环境适应性、进化与演变历程等。也可以开展病原菌侵染后的甘蔗转录组学、蛋白质组学及代谢组学等多组学联合分析技术,探索甘蔗赤条病菌生态适应性、致病性基因的分子进化规律、病原菌的致病分子机理等基础理论研究。

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