间充质干细胞来源的外泌体在炎症性肠病治疗中的作用机制及应用前景

杨少鹏 综述 张晓岚 审校

炎症性肠病（inf lammatory bowel diseases，IBD）是一种病因和发病机制尚不十分明确的非特异性肠道疾病，主要包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，其发病率逐年提高[1]。该病病程长，易复发，甚至出现各种全身并发症及癌变，严重影响患者的生活质量与生存期。目前治疗IBD 的药物如糖皮质激素及免疫抑制剂等不良反应较多，对于重症患者疗效有限[2]。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）是发病机制中关键的靶点，抗TNF 药物英夫利西单抗和阿达木单抗等生物制剂的问世让IBD 的治疗效果得到了很大的改善，是重症患者的“拯救性”治疗药物。然而，约有30%的患者对英夫利西单抗原发性无应答[3]，并且近20%～40%患者由于继发性失应答或严重的不良反应而停药[4-5]，其他新型生物制剂也仍处于起始阶段。因此，探索IBD新的治疗手段对改善目前的治疗困境具有重要意义。

干细胞移植是IBD 治疗领域的研究热点，其中间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因具有抑制炎症、调节免疫紊乱及促进黏膜修复等作用，有望成为IBD 的新兴治疗手段。随 着研究不断深入，研究者们发现经静脉移植的MSCs 大多数停留在肝脏与肺部，只有＜ 1%会最终定植于受损肠道[6-7]，却仍能有效缓解结肠炎小鼠的肠道炎症。这些研究间接说明MSCs 可能通过分泌具有抗炎功能的生物活性物质发挥作用。MSCs 来源的外泌体（mesenchymal stem cells- derived exosome，MSCs-Exo）是MSCs 通过旁分泌的纳米级细 胞外囊泡，具有MSCs 的大部分功能，无恶性分化且较MSCs免疫原性更低[8]，更好地弥补MSCs移植应用中的不足。本文综述了MSCs-Exo 的概况及其在IBD 治疗中的机制及应用前景，以期为深入研究MSCs-Exo 治疗IBD 方面提供借鉴。

一、外泌体的形成、成分与功能

外泌体是1981年首次由Trams 等[9]提出的一类直径约40～160 nm（平均100 nm）的纳米级双层膜结构的外囊泡。外泌体的形成始于细胞内吞与细胞膜内陷，细胞通过这两种方式将胞外的物质，如蛋白质、脂类以及代谢产物连同细胞表面蛋白一起进入细胞，在高尔基体与内质网的作用下形成早期胞内体[10]。早期胞内体经发育成熟后成为晚期胞内体，晚期胞内体膜包裹多个含有特异分选的蛋白、核酸等物质的管腔囊泡形成多泡体（multivesicular bodies，MVBs）。随后，大部分MVBs 与溶酶体或自噬小体融合最终导致 MVBs 的内含物降解，而少数MVBs 通过其膜表面的CD63、溶酶体跨膜蛋白1、溶酶体跨膜蛋白2 等与细胞质膜融合，并向胞外释放将所含的管腔囊泡形成外泌体[11-13]。

外泌体含有丰富的内容物，例如蛋白质、核酸和脂质等。根据ExoCarta 数据库（http://www.exocarta.org/）最新显示，已在外泌体中检测出41 860种蛋白、1 116种 脂质、3 408种信使RNA（messenger RNA，mRNA）及2 838种微小RNA（microRNA，miRNA），它们分别在外泌体中扮演十分重要的角色。例如外泌体的胞浆蛋白Rabs 和Annexin 可调节膜骨架动态性且有利于膜融合[14]；而膜蛋白CD9、CD63 及CD81定位于外泌体的表面并用于外泌体的鉴定[15]。脂质中的神经酰胺与外泌体的形成与释放密切相关[16]。外泌体中的另一重要的物质miRNA 是众多研究者们关注的焦点，当母细胞分泌的外泌体进入靶细胞后，它们携带的miRNA 将与靶基因结合调控其表达进而影响靶细胞生理功能。目前人们对外泌体内容 物在不同疾病中作用的了解仍十分有限，何种内容物为外泌体发挥功能的 关键分子值得进一步探索。

二、MSCs-Exo 在IBD 中的治疗作用

（一）MSCs-Exo 具有治疗IBD 的潜能

外泌体不但能够反应机体的生理状态，还与其来源的细胞具有相似的功能。因此，外泌体除了可用于作为疾病的诊断标记物外，其治疗功能更是备受关注，尤其是来源于MSCs 的外泌体。MSCs 是一类来 源于中胚层的多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，能够发育成骨、脂肪等并可以接受移植[17]，是目前基础和临床研究最广泛的干细胞种类之一。最初研究者发现，将MSCs 的条件性培养基注射到实验性结肠炎小鼠的腹腔后，可缓解肠道炎症，减轻疾病活动指数并且提高模型鼠的存活率，与MSCs 疗效无明显差异[18]。该研究初步说明了MSCs 可能通过旁分泌途径发挥抗炎功能。国内学者Yang 等[19]在2015年从骨髓MSCs 中分离出细胞外囊泡（主要为微囊与外泌体），进行动物实验发现MSCs 来源的外囊泡可逆转三硝基苯磺酸钠诱导的实验性结肠炎。因此，该研究在MSCs-Exo 治疗IBD 研究领域中打开了新视角。

（二）MSCs-Exo 治疗IBD 的机制

MSCs 应用于IBD 治疗的研究已经取得较大的进展，但是MSCs-Exo 在IBD 中的治疗作用与机制的探索仍处于起步阶段。MSCs-Exo 治疗IBD 的作用机制可能是多方面的，从现有的研究上看，主要集中在免疫调节及促进肠道上皮屏障修复两大方面。以下将主要从这两方面介绍MSCs- Exo 治疗IBD 的可能机制。

1.MSCs-Exo 调节肠黏膜固有免疫：肠黏膜免疫异常，主要包括固有免疫和适应性免疫，是导致 IBD 发病的关键因素[20]。固有免疫为肠黏膜免疫异常的启动因素，巨噬细胞作为抗原递呈细胞参与其中并发挥重要作用。目前多数研究主要集中于MSCs-Exo 对巨噬细胞的调控方面，尤其是MSCs-Exo 调控巨噬细胞向抗炎表型分化在IBD 中的作用及机制等方面已经取得进展。体外研究发现，将脂多糖刺激后的巨噬细胞与来自骨髓MSCs-Exo 共培养，发现24 h后带有绿色荧光标记的MSCs-Exo 能够被巨噬细胞摄取，将M1型促炎巨噬细胞分化为M2型抗炎巨噬细胞，下调白介素 -6（interleukin 6，IL-6）、TNF-α 及IL-12 等炎症因子的表达[21]。该现象也在动物实验中得到进一步证实[21-22]。值得注意的是，当应用氯膦酸二钠脂质体清除小鼠体内的巨噬细胞后，发现MSCs-Exo 在实验性结肠炎小鼠中的 治疗效果降低[23]。因此，巨噬细胞可能是MSCs-Exo 发挥治疗作用的关键效应细胞。有学者进一步研究发现，脂肪MSCs-Exo 中含有炎症保护因子TNF-α 刺激基因-6（TNF-α stimulated gene-6，TSG-6），该抗炎因子可能是调控M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化的关键蛋白[24]。

2.调节适应性免疫：适应性免疫是IBD 发生并呈慢性持续状态的重要环节，CD4+T细胞是肠黏膜免疫的主要效应细胞。在抗原刺激下CD4+T细胞可被诱导分化为调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）和辅助性T细胞（T helper cell，Th）。目前MSCs-Exo 对适应性免疫调控的研究尚不多见，主要集中于Th17 及Treg细胞。Th17细胞参与IBD 的发生，Th17细胞过度增殖与活化与溃疡性结肠炎的疾病活动情况有关[25]。Chen 等[26]发现来源于骨髓MSCs 的外囊泡（包含外泌体）可能通过抑制Th17细胞转录因子RORγt及STAT3 的表达，从而下调结肠炎大鼠脾脏及肠系膜淋巴结中Th17细胞的比例及IL-17A、IL-21 等炎症因子的分泌减轻肠道炎症，其治疗效果可能存在剂量依赖。然而该研究所提取的骨髓MSCs 外囊泡直径为30～1 000 nm，成分相对复杂，可能存在外泌体以外的物质，因此未能直接证明MSCs-Exo 对Th17细胞的调控作用。具有免疫耐受调节功能的Treg细胞在维持肠道黏膜免疫的稳态中扮演着重要的角色，IBD患者多存在Treg细胞数量或功能异常。An 等[24]分离出犬骨髓的MSCs-Exo 与犬的外周血单个核细胞共培养，发现MSCs-Exo 可提高Foxp3+T细胞比例；进一步通过动物实验发现与对照组相比，腹腔注射MSCs-Exo 的实验性肠炎小鼠肠道炎症更轻，结肠黏膜中Foxp3+T细胞数提高。该研究从细胞及动物两个水平上说明了MSCs-Exo 调控Treg细胞的分化可能是其治疗IBD 的重要途径。

3.提高MSCs-Exo 免疫调节功能的途径：除此之外，应用炎症因子对MSCs 进行预处理可能提高MSCs-Exo 的免疫调节功能及抗炎能力。有研究应用TNF-α 及干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）预处理MSCs后再提取外泌体，发现预处理后的MSCs-Exo 中具有免疫抑制功能的蛋白，如TSG-6、转化生长因子-β 及前列腺素E2 等，其表达均高于未处理组；而且经TNF-α 及IFN-γ 预处理后的MSCs-Exo促进Treg细胞及M2型抗炎巨噬细胞分化的能力有所提高，在实验性结肠炎小鼠中的治疗效果更好[27]。MSCs 的免疫调节能力与其所处的微环境密切相关，不同培养条件所获得的MSCs-Exo 免疫调节功能可能存在差异[28]。因此，从改变MSCs 的培养条件为视角，如缺氧、炎症因子预处理及3D 培养等，探索提高MSCs-Exo 治疗效果的方案值得进一步研究[29-30]。

4.MSCs-Exo 促进肠上皮屏障修复：肠上皮屏障由肠上皮细胞紧密连接组成，在抵御病原体入侵及维持肠黏膜正常功能中发挥重要作用，而肠上皮屏障损伤是IBD 的重要病理改变[31]。骨髓MSCs 分泌的外囊泡通过下调实验性结肠炎大鼠结肠中caspase3、caspase8 及caspase9 的表达，从而抑制肠上皮细胞的凋亡修复受损肠道，并且这种抑制效应与所注射的外囊泡剂量有关[19]。另一研究将MSCs-Exo 注射到坏死性小肠结肠炎大鼠模型中，4 h后检测大鼠血清发现注射MSCs-Exo 大鼠血清中FITC-D 浓度低于PBS 注射组，证明了MSCs-Exo 能够降低肠黏膜的通透性，进而维持肠上皮屏障的完整，促进受损肠道修复[32]。McCulloh 等[33]通过应 用不同细胞来源的MSCs-Exo 对同样的疾病模型进行干预后也证实了这一现象。以上的研究均未对MSCs-Exo 修复肠上皮屏障的机制做进一步探讨。

5.MSCs-Exo 通过miRNA 发挥治疗作用：除了上述介绍的作用机制外，MSCs-Exo 还可能通过miR-146a 与炎症基因TRAF6 和IRAK1 靶向结合抑制基因的表达，从而减轻肠道炎症[34]。其次，MSCs-Exo 还能通过miR-200b 抑制肠上皮间质转化途径，减少实验性结肠炎相关肠纤维化的发生[35]。以上结果表明，MSCs-Exo所携带的miRNA 可能是其发挥治疗作用的另一重要内容物。此外，抑制泛素蛋白表达，进而降低NF-κB 和mTOR 的活化也是MSCs-Exo 改善肠道炎症的机制之一[36]。

三、MSCs-Exo 在IBD 中的应用前景

与MSCs 相比，其分泌的MSCs- Exo 具有更低的免疫源性，而且无细胞增殖特性，能在体内稳定存在等优势[36]，可用于弥补MSCs 移植的不足甚至可能替代MSCs 成为IBD 的新兴治疗方法。在美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）注册的临床试验（ClinicalTrials.gov）显示，MSCs- Exo 在临床试验中的研究主要治疗的疾病为Ⅰ型糖尿病、脑血管疾病及黄斑裂孔等，还未涉及到IBD[11]。目前MSCs-Exo 在IBD 中的研究尚不多见，其中大部分为临床前基础研究。实验用于提取MSCs-Exo 的MSCs 主要来源于脐带、骨髓或者脂肪，并且已经在细胞及动物水平上开展研究，以验证MSCs-Exo 在IBD 治疗中的有效性。在细胞实验中，Rager 等[32]通过肠上皮细胞划痕试验发现骨髓来源的MSCs-Exo 提高肠上皮细胞划痕的愈合率，改善肠上皮屏障功能；此外，MSCs-Exo 被巨噬细胞摄取后可抑制M1型巨噬细胞极化，下调炎症因子水平发挥抗炎作用[21,24]。在动物实验方面，研究所采用的动物模型大部分为三硝基苯磺酸和葡聚糖硫酸钠诱导的实验性结肠炎大鼠或小鼠模型。这些研究重点观察了MSCs- Exo 的治疗作用，证实了MSCs-Exo 能够减轻结肠炎动物模型便血、体重下降等症状并改善组织病理评分，提高了动物的存活率[21,36,38]，其机制可能与MSCs-Exo 具有抗炎、调节免疫及促进肠道修复等作用有关。这些 研究为未来MSCs-Exo 在IBD 临床治疗中的应用奠定了基础。因此，MSCs-Exo 在IBD 的治疗中具有广阔的应用前景。

四、MSCs-Exo 在IBD 治疗中的局限性

虽然大多数基础实验表明MSCs-Exo 是潜在治疗IBD 的“新武器”，但MSCs-Exo 应用于IBD 的临床治疗仍存在许多问题亟待解决。首先，MSCs-Exo 除了含有蛋白质、脂质及miRNA 等内容物外，可能还含有其他物质，如lncRNA、piRNA及circRNA 等非编码RNA[39]。目前人们对于这些RNA 的功能了解不多，它们在IBD 中发挥什么作用、何种非编码RNA发挥主要作用仍有待确定。其次， 动物实验表明MSCs-Exo 的治疗效果存在剂量依赖[26,33]，而且MSCs-Exo 应用于临床试验前更需要确定安全有效的剂量范围。因此，MSCs-Exo 应用于临床试验前需要确定标准化定量的方法。目前用于确定MSCs-Exo 剂量主要根据提取外泌体母细胞的数量、外泌体的蛋白浓度或者外泌体的粒子数等，哪种量化方法更适用于临床，仍存在许多争议[40]。最后，不同的分离方法所获得的MSCs-Exo 纯度及数量可能存在差异，而且不同的给药途径可能影响IBD 的治疗效果[41]。因此，MSCs-Exo 需要不断优化提取方法，选择合适的给药途径以提高临床疗效。

五、总结与展望

MSCs-Exo 免疫源性低、易保存且运输方便，同时具有MSCs 大部分功能，有望成为一种新兴的“无细胞”治疗方法。如前文所述，目前MSCs-Exo 在治疗IBD 中的研究尚处于起步阶段，仍存在许多问题未解决。在探索MSCs-Exo内容物的功能方面，研究多集中于探讨MSCs-Exo 通过递送miRNA 发挥治疗作用。然而MSCs-Exo 除了含有miRNA 外，还有大量具有功能的非编码RNA。以MSCs-Exo 为载体，利用第三代基因组测序的技术，寻找其 中具有关键作用的非编码RNA 并探讨它们对靶细胞表观遗传调控的潜能，对阐明MSCs-Exo 治疗IBD 的作用机制具有重要意义。另一方面，结合IBD 以消化道受累为主的疾病特征，对比不同给药途径及不同剂量在治疗效果中的差异，可能为优化IBD 的治疗方案提供实验依据。

综上所述，由于独特的生物学特性及功能，MSCs-Exo 可能成为IBD 潜在的治疗药物。围绕着MSCs-Exo 内容物的功能、提取与定量标准及给药途径等方面展开研究，将加快MSCs-Exo 应用于临床治疗IBD 的步伐。