胰腺或胰岛移植后1型糖尿病复发的预测

胡启桢 张梅

1型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）是在遗传易感性和环境诱发因素等多因素共同作用下，体内产生针对胰岛β细胞的自身免疫应答，导致β细胞破坏，最终胰岛素合成绝对不足[1-2]。随着胰腺移植和胰岛移植在治疗难治性T1D 的进展，1型糖尿病复发（type 1 diabetes recurrence，T1DR）导致的移植物功能丧失受到越来越多的关注。如何预测T1DR 发生并及时采取干预措施，对延长移植物存活率至关重要。

一、T1DR

20 世纪90年代以来，越来越多的临床研究证实胰腺移植和胰岛移植能够恢复终末期T1D患者的生理性胰岛素分泌，减少严重低血糖事件的发生风险，甚至逆转包括肾脏病变在内的慢性并发症，是治愈T1D 的理想方法[3-5]。随着免疫抑制方案的改善，移植后的急性排斥反应相对少见，移植物近期存活率大幅度提高[6]。远期移植物功能丢失常归因于慢性同种排斥反应。然而，不可忽略的另一可能导致远期移植物功能丢失的免疫学因素，是胰岛自身免疫复发，即T1DR[7-9]。20 世纪80年代，Sutherland 等[7]团队首次报道T1DR。T1DR 的临床表现为患者胰腺术后复发性高血糖和恢复对胰岛素的依赖，组织学特征为移植胰外分泌腺和血管内膜近乎正常的情况下，T细胞特异性浸润胰岛导致选择性的β细胞丢失。

由于T1DR 的复发性高血糖表现缺乏特异性，许多研究中心并未定期监测胰岛自身免疫状态。因而，以往认为胰腺移植或胰岛移植后的T1DR 是罕见的。美国迈阿密大学糖尿病研究所自2003年开始关注移植术后T1DR，据报道，由慢性胰岛自身免疫复发导致的移植物功能丧失占7%，与慢性同种排斥反应的发生率相当[9]。这意味着一直以来T1DR 的发生率在临床中被大大低估了。

二、T1DR 的发生机制

多项研究发现在T1D患者和部分健康对照组中均可检测到针对β细胞自身抗原表位 的CD4+或 CD8+T细胞[10-13]，二者的关键区别在于，前者的自身反应性T细胞呈现出一种抗原敏感状态。这主要表现在：（1）T1D患者的自身反应性T细胞在缺乏CD28/B7 共刺激信号的情况下，在体外仍可对β细胞抗原刺激产生增殖反应[10]；（2）T1D患者的自身反应性T细胞主要表达CD45RO 记忆细胞表型，而健康对照组几乎均为CD45RO-或CD45RA+的幼稚细胞表型[11-12]；（3）T1D患者自身反应性CD4+CD45RO+T细胞的端粒长度较CD4+CD45RO-T细胞缩短，这意味着前者在体内历经了自身抗原刺激导致的激活和有丝分裂[13]。这些具有记忆表型的自身反应性T细胞的形成和持续存在是胰岛移植后自身免疫复发的病理基础[14]。

供体胰岛除了表达人类白细胞抗原外，还可表达能被受体自身反应性的记忆性T细胞识别和靶向的自身抗原，使得抗原特异性的T细胞和B细胞被再次激活，且临床上尚无能够阻遏这一过程的免疫抑制剂[15-16]。尽管目前认为T1DR 是由受体体内预先存在的记忆细胞克隆引起的，但它们是如何识别和破坏供体人类白细胞抗原不匹配的移植物β细胞仍有待进一步阐明[14]。

三、T1DR 的生物标志物

移植物组织活检是T1DR 诊断的 “金标准”。然而，由于它是一种有创性操作，在缺乏相关代谢或免疫学指标高度怀疑T1DR 的情况下，移植物组织活检并不是筛查的首选方法[17-18]。另外，由于肝内胰岛移植的特殊性，经皮肝穿移植物的成功率低，可靠性差，难以获得足够用于病理学检查的胰岛组织[19]。

2017年国际胰腺和胰岛移植协会（International Pancreas and Islet Transplant Association， IPITA）和欧洲胰腺和胰岛移植协会（European Pancreas and Islet Transplant Association，EPITA）召开会议，就术后移植物功能和结局评估达成共识。此共识将移植物β细胞功能评估分为最佳（Optimal）、良好（Good）、功能不足（Marginal）和无功能（Failed）4个等级，并推荐联合使用糖化血红蛋白、严重低血糖事件的发生、C肽和每日胰岛素需要量4 项代谢相关指标[20]。然而，这些指标缺乏早期诊断复发性胰岛自身免疫对移植物功能损伤的敏感性和特异性。相比之下，包括胰岛特异性自身抗体和抗原特异性T细胞在内的免疫学指标似乎更能反映T1DR 发生风险以及其对移植物早期损伤，这对预测疾病进展、评估干预措施的有效性、保护和延长移植物功能是至关重要的。

（一）胰岛特异性自身抗体

胰岛特异性自身抗体有5种，包括胰岛细胞抗体、胰岛素抗体、谷氨酸脱羧酶抗体（glutamic acid decarboxylase antibody，GADA）、胰 岛 素 瘤 相 关 蛋 白2 抗 体（islet cell antigen-2 antibody，IA-2A）、锌 转 运 体8 自 身 抗 体（zinc transporter 8 antibody，ZnT8A）。胰岛自身抗体的检测是临床上评估T1D患者胰岛自身免疫的金标准，多种抗体联合检测对T1D 预测和诊断有极其重要的价值[21]。但是，胰岛自身抗体对胰腺或胰岛移植术后T1DR 的预测和诊断价值仍有待进一步验证。

Braghi 等[22]回顾性地分析了110例胰肾联合移植患者，并对其中75例患者进行了长达11.2年的连续随访。他们发现移植前GADA 和（或）IA-2A 的存在与5年移植物存活率无关，这一结论弥补了前人的空白并且在后续的研究中得到证实[9,23-26]。相比之下，术后多种自身抗体[8]及自身抗体的变化[22,24-25,27-30]，包括血清转化、表位扩散、滴度水平升高与不良的移植物结局有关。Martins 等[24]和Rodelo-Haad 等[31]分析了术后自身抗体的存在与血糖控制的关联，与自身抗体阴性组对比，伴有GADA、IA-2A、胰岛细胞抗体或胰岛素抗体中任意一种抗体的患者平均糖化血红蛋白水平更高，C 肽水平更低，且糖化血红蛋白的差异在GADA 阳性的人群中尤为明显[24]。Rodelo-Haad 等[25]进一步比较自身抗体的种类对移植物结局的影响，发现术后IA-2A 抗体阳性患者胰腺移植物存活率低于抗体阴性和GADA 阳性的患者。

ZnT8A 目前被国际公认是继胰岛细胞抗体、胰岛素抗体、IA-2A、GADA 之后的第5种主要胰岛自身抗体。近年来人们发现了ZnT8A 与T1DR 的发生有着很强的时间关联。Vendrame 等[33]通过对1例胰肾联合移植患者进行随访观察，发现该患者术前与术后5年内GADA、IA-2A 和ZnT8A均为阴性并能维持良好的胰岛素脱离，但是ZnT8A 水平在复发性高血糖前3个月骤然升高至临界值的40倍左右，随后不久GADA 水平也升高。迄今为止最大的全面评估T1DR发生危险因素的队列中，研究人员比较了GADA、IA-2A 和ZnT8A 从移植到血清转化，从血清转化到T1DR 发生以及自身抗体阳性持续时间[9]。研究结果显示这3种抗体在移植后转化的时间类似，但是ZnT8A 的特点在于：（1）从ZnT8A阳性到发生T1DR 的时间短于IA-2A（P= 0.0004）和GADA（P= 0.0530），提示ZnT8A 阳性预示在近期可能出现明显的T1DR 症状；（2）ZnT8A 阳性的持续时间短于IA-2A（P=0.0007）和GADA（P= 0.0300）。另外，将ZnT8A 纳入到常规的自身抗体监测谱（GADA 和IA-2A）中作为预测移植物功能丢失的指标，其灵敏度达95%，特异度达80%，且可将预测的准确率由60%提高到80%[25]。

（二）胰岛抗原特异性T细胞

针对胰岛抗原特异性的T细胞反应，被认为是预测胰腺或胰岛移植临床结局和评估T1DR 进展最具潜力的方法。虽然近年来不同的实验室通过体外增殖法、主要组织相容性复合物Ⅰ类多聚体或Ⅱ四聚体法来表征或定量检测移植受者外周血中抗原特异性的T细胞，但是此类技术标准化程度低，操作复杂，限制了其在临床上的广泛应用[34]。

1.CD4+自身反应性T细胞：早期的研究表明，β细胞抗原引起的体外淋巴细胞增殖反应与胰岛移植物的功能丧失有关[35]。之后两项回顾性研究比较了基线和胰岛移植后胰岛自身免疫状态对移植结局的影响，发现基线时谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）和（或）胰岛素瘤相关蛋白2 T细胞反应与术后较高的空腹血糖变异性和较低的血浆C 肽水平相关，在单一变量分析中术后T细胞对胰岛自身抗原的反应性和移植物功能不相关[23,27]。移植前后自身抗原反应性T细胞阳性组无一能够脱离胰岛素治疗，而术后转阴组中67%的患者可达到胰岛素脱离[23]。

主要组织相容性复合物多聚体的发展使得定量分析抗原特异性T细胞成为可能。迈阿密大学糖尿病研究所在3例经组织学确诊T1DR 患者的外周血和（或）胰腺引流淋巴结检测到GAD65 或胰岛细胞特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白特异性的T细胞。通过给予靶向T细胞、B细胞和自身抗体的免疫抑制治疗，包括抗胸腺球蛋白、达克珠单抗、利妥昔单抗和血浆置换疗法，患者表现为外周血中抗原特异性的T细胞频率降低到临界值以下，自身抗体出现波动，C 肽分泌维持在较好的水平。然而，在1年内随着抗原特异性T细胞再次出现在外周血中，患者自身抗体水平再次升高，C 肽分泌呈持续下降[33]。值得注意的是，对不同随访时间点外周血GAD65 特异性CD4+T细胞群进行T细胞受体的分析，结果显示直接与抗原肽结合并决定T细胞受体抗原特异性的β 链互补决定区3 的序列相同[33,36]。因此，这进一步显示非特异性抑制治疗可能不会对胰岛自身免疫产生持久的抑制作用，在移植术后很长时间内仍可鉴定具有相同互补决定区3 序列的GAD65 特异性CD4+T细胞群，体现了T1D 免疫记忆的持久性。

2.CD8+T细胞：自身反应性 CD8+T细胞克隆可直接杀伤胰岛β细胞，故而被认为是胰腺或胰岛移植后监测的最重要细胞类型[16]。T1DR 患者外周血中胰岛素B10-18特异性CD8+T细胞比例高于术后移植物功能良好组和因同种异体排斥反应致移植物功能丧失组[37]。在移植术后的多个时间点检测到针对多种抗原表位的CD8+T细胞是复发性胰岛自身免疫的标志[38]。传统的酶联免疫斑点技术和人类白细胞抗原-多聚体法在检测多种抗原特异性T细胞反应时需要患者的大量血液，为了克服这一缺点，研究人员开发出一种“Diab-Q-kit”法[39]。这种方法可以利用有限的、经过冷冻储存的外周血同时检测一系列胰岛自身反应性CD8+T细胞，包括胰岛素B10-18、前胰岛素原15-24、胰岛素瘤相关蛋白2797-805、GAD65114-123、胰岛细胞特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白265-273、胰岛前淀粉样多肽5-13 特异性 CD8+T细胞[40]。该方法预测6例胰岛移植受者将恢复胰岛素依赖性，实际上最终4例患者需要注射外源性胰岛素，准确率为66%。有趣的是，在2例经过抗胸腺球蛋白免疫诱导治疗的患者中最先出现了胰岛素B10-18和前胰岛素原15-24 特异性CD8+T细胞。这些细胞的重新出现，可能是免疫抑制治疗淋巴细胞减少后的稳态增殖所致[41]，尽管在抗胸腺球蛋白治疗后未在外周血中检测到，但它们仍以记忆细胞群长久存在于淋巴器官中。Monti 等[41]证实，达克珠单抗、雷帕霉素和他克莫司的免疫抑制会导致慢性的淋巴细胞减少和反应性白细胞介素-7与白细胞介素-15 因子水平升高，从而驱动外周记忆性T细胞扩增，包括胰岛抗原反应性的CD8+T细胞。

四、总结

越来越多的研究提示，胰腺或胰岛移植术后T1DR 是影响T1D患者远期移植物存活的主要原因之一。对胰岛自身抗体和抗原性T细胞的监测有助于了解患者的自身免疫状态，这对预测复发性胰岛自身免疫对移植物的损伤、予以适当的免疫干预治疗、评估治疗的临床疗效有重要的价值和临床意义。胰岛抗原特异性T细胞在T1DR 中发挥的作用及其机制需要进一步探究，以此作为靶点研制新型免疫抑制剂将是预防和治疗T1DR 的新方向。