miRNA在肾细胞癌中的研究进展

陈立新 综述 赵玉婉，柳建军 审校

广东医科大学附属医院泌尿外科，广东 湛江 524000

肾细胞癌(RCC)是一种常见的致死性恶性肿瘤，约占成人恶性肿瘤的5%，是全球十大最常见癌症之一。20%～30%的肾细胞癌患者在被确诊后仍有病情局部加重或肿瘤发生转移，30%～50%的肾细胞癌患者在原发肿瘤切除后病情仍得不到控制[1]。目前，手术切除是肾细胞癌患者的主要治疗方法，但由于肾细胞癌患者对化疗和放疗的抵抗，肾细胞癌很容易发展为恶性潜伏期。因此，进一步了解肾细胞癌的具体分子机制至关重要。

1 miRNA简介

自1993 年首次在秀丽隐杆线虫的研究中发现miRNA 后，人们很快意识到其广泛而重要的作用[2]。microrna(miRNA)是一组内源性非编码功能RNA，长度约为18～25个核苷酸，广泛存在于动植物中，其生物合成和调控功能在维持细胞内平衡中具有重要意义。miRNA 是由位于基因间区和内含子基因区域的DNA区域转录而来，但也存在于外显子基因区域和反义转录本中[3]。miRNA 从初始加工到最终成熟，均由RNA聚合酶Ⅱ转录，这些RNA聚合酶在5'端生成含有帽状结构的茎环初级miRNA(pri-miRNA)，并在3'端发生聚腺苷酸化[4-6]。然后，在细胞核中，通过Drosha/DGCR8 复合物将pri-miRNA 裂解为茎环前体miRNA(pre-miRNA)，之后，出口蛋白5(XPO5)通过核孔介导易位将pre-miRNA 转运到细胞质中，RNase ⅢDicer和TARbinding protein (TRBP)进一步处理该分子，转化为包含miRNA-guide 链和miRNA-passenger 链的双链成熟RNA。它们与Argonaute 一起被整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，以沉默靶向mrna(mRNA)[3，7-8]。单个mRNA可能被多个不同的miRNA靶向，其效率各不相同，相反，一个miRNA可以靶向一个以上的mRNA。miRNA 通过与靶向mRNA 序列的结合，具有多种生物学功能，如抑制或促进许多相关基因表达的能力，而这些基因可以影响肿瘤发生发展所必需的细胞生物学功能，如细胞增殖、分化、迁移和凋亡[9-10]。

2 miRNA与肾细胞癌

微阵列表达数据证明了miRNA 表达异常在癌症中非常常见[11-12]。随着基因组学的发展，通过基因芯片、实时PCR 等高通量技术，在肿瘤组织和正常组织中可以快速建立miRNA表达谱，并证实在大多数肿瘤中miRNA表达失调[13-14]。此外，miRNA在临床上可应用于癌症管理，不仅在肿瘤诊断，而且可评估恶性肿瘤治疗效率，并监测肿瘤复发和进展情况。RCC占所有成人恶性肿瘤的2%～3%，占肾脏原发性恶性肿瘤的90%，是仅次于前列腺癌和膀胱癌的第三常见泌尿系肿瘤，死亡率极高[15]。肾细胞癌有多种组织学亚型，最常见的亚型包括透明细胞癌(ccRCC)、乳头状癌和嫌色性肾细胞癌。这些亚型加起来约占所有确诊肾细胞癌的90%。肾切除术是目前肾细胞癌患者最佳的治疗选择，但20%～40%的患者术后会发生复发和转移。由于转移性肾癌的预后情况比较差，而且其对放疗、化疗均不敏感，临床上尚无辅助治疗，3 年平均存活率低于5%[16]。目前，RCC 的一些预后因素被应用于临床，包括肿瘤分期、Fuhrman 分级、淋巴结受累和组织学亚型。然而，这些因素在预测疾病方面缺乏准确性，尤其是在诊断非转移性疾病患者中。RCC的预后结果相差很大，现今用于该病早期检测和随访的现有生物标志很少，这导致其预后不良，因此寻找新的可靠的生物学标志物，对肾细胞癌的早期诊断、治疗及预后有重大意义。

3 miRNA在肾细胞癌中的表达

大量的研究证明，miRNA 可通过调节细胞代谢、分裂、分化、发育和凋亡等关键过程，进而在肾细胞癌中扮演抑癌基因的角色和癌基因的角色。近年来，人们在发现新的miRNA、识别miRNA 靶点和破译miRNA功能方面进行了大量的研究[17]。而计算方法的应用有助于阐明miRNA的生物学作用，因为生物信息学可以通过建立一种假设来揭示统计上显著的趋势，然后通过实验加以证实。例如，通过对miRNA数据集的综合分析，识别与肿瘤发展相关的miRNA[14]，此外，通过整合转录组分析已证实肿瘤中miRNA-mRNA的相互作用[18]。而且，通过综合生物信息学计算，可以探索miRNA表达与基因或通路之间的关系[19]。例如ZHOU等[20]从肿瘤基因组图谱(TCGA)中共获得525 个透明细胞RCC (ccRCC) miRNA 表达谱。将1.5 倍的差异定义为截止水平，在检测到的1 046个人类miRNA中，有143 个miRNA 表达在RCC 和邻近正常组织中存在显著差异，其中62 个表达下调，81 个表达上调，其中miR-124和MEG3显著下调。LIANG等[21]通过分析从TCGA 数据集中下载的miRNA 测序数据，在516 例CCRCC患者中发现63个差异表达的miRNA，其中34个表达上调，29个表达下调。HE等[22]利用微阵列基因芯片技术观察到，在9 对ccRCC 样品中，11 个miRNA在不同阶段普遍失调，其中3 个上调(miR-491-3p、miR-487a和miR-487a)，而与正常组织相比，ccRCC样本 中 的 miR-125b、miR-142-3p、miR-199a-5p、miR-532-5p、miR-299-3p、miR-29a、miR-429 和miR-22分别下调。SZABÓ等[23]发现与正常组织相比，在24 个ccRCC 样本中miR-21 和miR-221 均显著升高，而且这些样本中，上述miRNA 共同表达高达79.2%(19 例)，而在正常样本中只有33.3%(8 例)共同表达。这提示miR-21 和miR-221 可能都参与了ccRCC的发生发展。

4 miRNA在肾细胞癌中的作用

越来越多的研究表明，miRNA在人类癌症的发生和发展中可能发挥了巨大的作用。许多miRNA 已经在人类基因组中被发现，其中大多数在癌细胞和人类肿瘤中失去了调控[17，24]。miRNA生物通路的突变和转录调控的解除以及表观遗传学的改变可能单独或更有可能共同促进miRNA 在肿瘤发生中的作用[18-19]。最近的一项研究表明，miR-200b 是上皮-间质转化(EMT)相关的miRNA[25]。EMT 参与癌细胞侵袭和转移的初始步骤，其与上皮特征的缺失和间充质标志物的获得有关，而miR-200b 通过靶向表达ZEB1 和ZEB2 可以阻止这一过程。LI 等[26]发现与相邻的正常组织相比，miR-200b 在临床RCC 标本中的表达水平明显较低，此外，miR-200b 的过表达不仅阻碍了Caki-1 和OSRC-2 细胞的增殖和迁移，还抑制了患者来源的异种移植物和细胞来源的异种移植物在裸鼠体内的转移。另一项研究表明，转移瘤抗原-1(MTA-1)作为人类肿瘤转移的关键介质，通过抑制E-cadherin(上皮细胞钙黏蛋白)转录，促进上皮-间质转化(EMT)过程[27]。YANG 等[28]则发现miR-30c 可降低Caki-1 细胞中MTA-1 的表达，进而抑制了细胞的增殖、侵袭、迁移。这提示miR-30c 可能参与下调MTA-1，抑制ccRCC 的发展。WANG 等[29]研究表明，在A498和786O细胞系中上调miR-30e-3p，通过直接靶向其3'-UTR，可以明显降低Snail1的表达，显著增强ccRCC细胞的侵袭和迁移。转染缺乏3'-UTR的A498和786O 细胞，其增强了Snail1 的表达，与转染空载体的细胞相比，miR-30e-3p抑制了ccRCC细胞的侵袭和迁移，这些结果表明，miR-30e-3p 通过直接抑制Snail1而增强了ccRCC细胞的侵袭和迁移能力。而有人利用TargetScan 工具，发现RAB23 是miR-384 的一个潜在靶基因，其是GTPases Rab 家族成员，是Sonic hedgehog基因信号通路的负调控因子，在癌症的发展中起着重要的作用；与非肿瘤组织相比，RCC 组织中RAB23表达上调，35例患者中22例(22/35，62%)RCC组织中RAB23 表达较高，证明了在RCC 组织中miR-384的低表达与RAB23的高表达有关，即RAB23的过表达促进了RCC细胞的增殖、迁移[30]。HE等[31]则通过生物信息学研究，发现HOXA3 mRNA 是miR-10b的一个潜在靶点，进一步研究发现，过表达的miR-10b 抑制HOXA3 的表达，而miR-10b 的缺失显著增强了HOXA3 的表达。此外，在ccRCC 细胞中敲低YAP 可明显减少HOXA3 表达而敲低FAK 可同时降低YAP 和HOXA3 表达。显然，这证明了miR-10b通过靶向ccRCC 中FAK/ YAP 信号通路调控的HOXA3 抑制细胞的侵袭和转移。miR-218 在ccRCC组织中的表达水平低于相邻非肿瘤组织，其低表达与更具侵袭性的肿瘤表型特征(包括更大的肿瘤和更高的肿瘤分期)显著相关，而在功能检测中，miR-218 过表达显著抑制癌细胞增殖和迁移。

5 预后生物标志物

RCC患者的预后差异很大，早期发现有复发风险的患者可以改善患者预后。目前临床上尚不能可靠地预测该疾病，因此确定新的生物标志物，可以帮助预测患者病情并改善预后。XIE等[32]从UCSC Xena下载临床信息和癌症基因组图谱数据库中ccRCC 的miRNA 表达谱，采用limma 包分析ccRCC 与正常组织中表达差异的miRNA，根据预后指数(PI)公式建立多变量Cox 回归模型，按中位PI 将ccRCC 患者分为低危组和高危组。利用miRNet 进行靶基因预测和功能富集分析，确定了miRNA-21-5p、miRNA-9-5p、miR-149-5p 和miRNA 30b-5p 作为独立的预后指标并使用这4 个miRNA 为每个患者构建一个4-miRNA PI。发现高危组(n=119)患者的生存时间明显短于低危组(n=118)(高危/低危组log-rank P=0.000)。与常规临床病理特征相比，4-miRNA是一个独立且全面的预后因素，其靶基因参与了与癌症相关的各种通路，如MAPK、p53、Wnt 信号通路。因此4-miRNA 信号与ccRCC患者的生存相关，可以作为ccRCC预后的生物标志物[32]。CARLSSON等[33]利用RT-qPCR检测116例ccRCC患者肾组织中miR-126、miR-21和miR-10b的表达。三种miRNA 在恶性组织和良性组织中均有差异表达，与良性组织相比，恶性组织中miR-126 (P=0.004)和miR-21(P＜0.001)上调，miR-10b(P＜0.001)下调。此外，miR-126 和miR-10b 在ccRCC 的分级和分期中也有差异表达。在单变量而非多变量模型中，miR-126的低表达与较短的复发时间有关,在研究的3个miRNA中，miR-126的表达最有可能作为ccRCC患者的预后标志物。QUAN 等[34]发现miR-23a-3p 在RCC 组织、RCC 细胞系中显著上调，通过上调miR-23a-3p 可增强细胞活力，而沉默miR-23a-3p 可抑制ACHN和786-O细胞系的细胞活力、增殖和迁移；进行cox 比例危险回归分析表明，低表达miR-23a-3p患者总体生存期显著延长。此外，通过FFPE 肾细胞癌样本分析miR-23a-3p 表达与患者总体生存率的关系，发现miR-23a-3p表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分期无显著相关性，然而，miR-23a-3p过表达与晚期肿瘤有统计学上的显著相关，即miR-23a-3p高表达的患者总体生存期显著缩短，故miR-23a-3p可能是RCC诊断、疾病监测和预后的一个可靠的生物标志物。LI 等[35]研究发现miR-31-5p 在786-0 和ACHN细胞周期的G2/M 期引起细胞周期阻滞。此外，在42份FFPE 肾细胞癌样本中，miR-31-5p 表达水平与性别、年龄、肿瘤大小或肿瘤分期无关，但miR-31-5p低表达与总体生存期低明显相关。Cox 比例危险回归分析进一步说明，在单因素和多因素分析中，miR-31-5p 低表达的患者生存时间更短(P＜0.05)，这为miR-31-5p 作为ccRCC 患者的预后标志物提供了理论基础。

6 治疗

近年来，很多研究阐明了miRNA 在RCC 中的作用规律，其不仅是检测预后的重要生物标志物，也是一种很有前景的治疗方法，而且研究表明miRNA相关治疗可能提高经典化疗的疗效。例如，研究发现，与对舒尼替尼治疗敏感者相比，对舒尼替尼治疗抵抗的ccRCC 患者miR-141 明显下调。舒尼替尼抗ccRCC的作用机制是通过抑制血管生成，诱导缺氧导致细胞凋亡，而在UMRC-2 和RCC4 细胞系的研究中发现，miR-141过表达主要源于缺氧环境，增加了对舒尼替尼的敏感性[36-37]。另外，YANG等[38]研究发现，miR-30c感染Caki-1细胞后，紫杉醇和索拉非尼明显抑制Caki-1细胞的存活和菌落形成能力。ZHONG等[1]利用生物信息学方法，证实HMGB1 为miR-505 的直接下游靶基因，且通过荧光素酶报告基因实验进一步证实，并发现HMGB1 在肾癌组织中明显过表达，与肾癌患者的临床预后密切相关。此外，体外敲除RCC细胞系中的HMGB1 可抑制肿瘤生长，为以HMGB1 为靶点对RCC进行再灌注治疗提供了新的理论依据[39]。

7 结语

miRNA 作为一种小分子的核苷酸非编码RNA，是细胞增殖、分裂、分化和凋亡等过程的重要调控因子；它们参与了RCC 的多种生物学和病理过程。本文综述了miRNA 的表达谱、生物学功能及其在RCC发生发展中的临床意义。大量的研究结果表明，miRNA 作为预测生物标志物和包括RCC 在内的不同肿瘤类型的新治疗方法正在出现。深入研究miRNA 调控RCC 发生发展的具体作用机制，对RCC的早期诊断、预后检测及治疗有重大的意义。但尽管近年来进展显著，对RCC 与miRNA 之间的关系仍不完全了解，miRNA 治疗应用仍存在一些问题，如靶向性差、安全性低等，因此，需要进一步研究及明确miRNA 在RCC 中的具体调控机制，为寻找新的miRNA 相关药物和特异性更高的药物提供坚实基础。相信随着科学技术及研究的发展，miRNA 在RCC 中的功能和具体作用机制会进一步明确，miRNA 在RCC 的早期诊断、预后检测及治疗等方面将发挥更大的作用。