非编码RNA与缺血性脑卒中后血管新生的研究进展

黄丽丹，陶华，陈润森，许向明 综述 钟望涛，崔理立 审校

广东医科大学附属医院神经内科，广东 湛江 524000

目前，治疗缺血性脑卒中最有效的方法是静脉溶栓，但是也仅有不超过1/3的患者通过血管再通，病情得到改善。鉴于多数患者预后不良，临床迫切需要更有效的治疗手段。已有研究表明，当大脑的供血动脉严重狭窄或闭塞时，血流通过新生血管侧支循环的方式，改善受损脑组织中的缺血缺氧状态，有助于神经功能的恢复[1]。也有研究证明脑缺血部位毛细血管密度较高的患者预后较好，死亡率亦较低[2]。因此，改善缺血区域的血管新生能力被认为是缺血性脑卒中的有效治疗方法之一[3]。

1 非编码RNA在血管新生调控中的特殊性

已有研究发现，许多血管生成因子和信号传导途径参与调节血管生长和形态发生[4]，例如血管内皮生长因子(VEGF)，是促血管生成的关键调控分子。在庞大的人类基因组中，编码蛋白质的DNA片段所占比例不超过2%，其余约98%的DNA 序列无蛋白质编码功能。后者的转录产物被称为非编码RNA(ncRNAs)，这提示ncRNAs 在血管生成过程中，可能较蛋白编码分子发挥更为广泛的调控作用。

事实上，ncRNAs 可根据长度划分为两类：小ncRNAs (＜200 bp，包 括piRNA、siRNA 和miRNA、snoRNA 等)和长ncRNA(lncRNA，＞200 bp)[5]。近年来，大量研究证实ncRNAs 在血管生成过程中的功能[6-8]，并且参与缺血性脑卒中后的病理恢复过程[9-10]，这提示它们可能是值得关注的潜在调控分子。

2 非编码RNA在脑梗死后血管新生中的研究

2.1 miRNA 与脑梗死后的血管新生 微小RNA(miRNA)是一类保守的非编码小RNA，通过靶向结合mRNA 的3'-非翻译区(3'UTR)，在转录后水平调控靶基因的表达。作为转录后基因沉默的重要介导，miRNA 在缺血性中风的病理过程中起着重要作用。JIN 等[11]通过检测急性脑梗死患者和健康对照者血浆中5 种血管生成相关miRNA (miR-126、miR-130a、miR-222、miR-218 和miR-185)的 表达 水平，发 现miR-126 和miR-130a 的表达水平与AIS 患者的疾病风险、严重程度和炎性细胞因子的表达水平相关。

2.1.1 miR-126 和miR-210 有学者认为，miR-126是内皮细胞中最丰富的miRNA，在血管生成中起着至关重要的作用[12]。PAN等[13]观察到miR-126过表达通过激活PI3K/AKT/eNOS 途径增加内皮祖细胞(EPC)的NO 产生，促进EPC 的增殖、迁移和管形成能力；转染miR-126的EPC显著减少MCAO小鼠的梗死体积和神经功能缺损评分，并可见脑微血管密度增加、脑血流量的改善和血管生成现象。也有研究发现，miRNA-126-3p和miR-126-5p的过表达通过下调PTPN9 和激活AKT/ERK 信号通路，促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖、迁移和管形成，改善缺血性小鼠脑梗死体积，促进脑缺血后血管重塑，并进一步改善神经行为恢复[14]。相反地，在体外和动物模型中，miRNA-126受EGFL7干扰后，可导致PI3K/AKT信号通路下调，并抑制HUVEC的管形成[15]。据报道，缺氧诱导的miR-210 是缺氧反应中血管生成和内皮细胞存活的关键调节剂，因其在低氧诱导条件下均一致表达上调而被认为是低氧标志性miRNA。miR-210 过表达可通过调控其靶蛋白BDNF 的表达水平，促进缺血性小鼠脑的血管生成和神经发生，进而改善长期神经行为结果[12]。有研究以环肽偶联外泌体(RGD-exo)作为递送系统，将miR-210 递送至MCAO 小鼠脑部，缺血区域VEGF表达增加，诱导局灶性血管生成，从而提高MCAO小鼠存活率[16]。

2.1.2 miR-26a、miR-195 和miR-150 如前 所述，VEGF 是促血管生成的关键调控分子，miRNA 通过直接或间接作用于VEGF 及其相关信号通路，调控血管生成的过程[7]。有研究发现miR-26a 通过激活AKT 和ERK1/2 途 径 上 调HIF-1a 的表达，从而介导VEGF 的转录活性，促进脑微血管内皮细胞(BMECs)中细胞增殖和血管生成[17]。与此相反，miR-195 通过下调其靶基因VEGFA 的表达水平，从而抑制内皮细胞侵袭能力和管形成[18]。相似地，miR-150 过表达特异性地抑制VEGF的表达，从而降低MCAO大鼠梗死区周围脑组织的血管密度，抑制BMVECs 的血管生成、增殖和迁移[19]。

2.1.3 miR-140-5p 和miR-377 鉴于部分miRNA 对血管生成具有抑制作用，有多个研究证实可通过敲低或抑制靶miRNA，以促进血管生成的基因表达和增加脑微血管形成。SUN 等[20]研究表明，抑制miR-140-5p 可以增加其靶基因VEGFA 的表达，从而增强HUVECs的增殖、侵袭、管形成。另有研究报道，抑制miR-377可调节EGR2的抗炎作用和VEGF的血管生成作用，促进了BMECs细胞增殖、迁移和毛细血管形成，并通过抑制MCAO大鼠的脑炎症和促进血管生成来减轻缺血性脑损伤[21]。

2.1.4 miR-124、miR-137 和miR-191 等 除了VEGF，miRNA 亦可通过其他血管生成因子及信号通路，调控血管新生过程。DOEPPNER等[22]证明锂通过增加miR-124 表达，降低RE1 沉默转录因子丰度，从而促进缺血后神经重塑和血管生成，进而改善脑卒中小鼠神经功能缺损及长期预后。也有研究表明，miR-137在MCAO小鼠中通过Notch信号通路靶向调控NR4A2，增加内皮祖细胞增殖和血管生成[23]，而miR-191 则直接调节血管内皮锌指1 (VEZF1)，导致VEZF1下游的各种血管生成因子发生变化，进而抑制缺血性脑损伤后血管生成[24]。此外，下调miRNA-27b通过诱导AMPK 的活化，增加了BMEC 管形成和迁移，增强MCAO 小鼠脑缺血边界区血管生成，进而促进缺血性中风后的恢复[25]，而miR-493 则通过直接靶向MIF 抑制RBMEC 的管形成和迁移，当其表达水平被下调后，缺血脑组织的毛细血管密度增加，梗塞体积减少并可见MCAO 大鼠的神经功能缺损得到明显改善[26]。

2.2 lncRNA 与脑梗死后的血管新生 LncRNA被定义为超过200 个核苷酸，没有编码蛋白质功能的RNA，曾被认为是基因组转录的噪音。然而，越来越多的研究提示，lncRNA 是血管生成过程中关键的调节因子，参与缺血性脑卒中后的血管生成过程[27-28]。

2.2.1 Meg3 Meg3 广泛表达于脑和内皮细胞。Meg3失活可促进血管生成的基因表达和增加脑微血管形成。研究报道，lncRNA Meg3 在体内和体外均负调节Notch 信号通路，减少缺血性脑组织的血管生成。Meg3 的沉默增加了内皮细胞迁移、增殖和管形成[27]。SHEN 等[29]证明敲 除Meg3 促 使 血 管生成 相 关基因Vegfa 和Vegfr2 上调，增强内皮细胞迁移和管形成，增加缺血脑的毛细血管密度，也可通过调节p53/NOX4 轴增强促HIF-1α和VEGF 表达，促进脑梗死后的血管生成，减少由OGD/R诱导的RBMVECs凋亡[30]。

2.2.2 MALAT1 MALAT1 也称为核富含丰富的转录本2(NEAT2)，是高度保守的lncRNA。在脑缺血后脑微血管内皮细胞中，Malat1是上调程度最高的lncRNA 之一，其参与保护BMECs[31]。有报道认为Malat1在体外和体内均与Bim和E-选择素结合，在脑微血管系统中发挥抗凋亡和抗炎作用，以减少缺血性脑 损 伤[9]。REN 等[32]进 一 步 发 现，Malat1 通 过 靶 向miR-145 直接上调VEGF-A 和ANGPT2，促进脑微血管内皮细胞血管生成，减少由OGD 诱导的BMECs 凋亡。此外，通过慢病毒载体转染，可见shMALAT1 降低了15-脂氧合酶1(15-LOX1)、VEGF 的表达以及信号传导和转录激活因子3(pSTAT3)的磷酸化，揭示了MALAT1 可能通过15-LOX1/STAT3 信号通路调节血管生成[33]。

2.2.3 SNHG12 SNHG12 是一种新型的lncRNA，在OGD处理后的BMEC和MCAO小鼠脑中表达均显著增加。在OGD/R 条件下，SNHG12 作为miR-150的竞争性内源RNA，抑制促炎细胞因子的表达，并促进促血管生成因子VEGFA 和FGFb 的表达，从而改善MCAO 小鼠神经功能的恢复[34]。值得一提的是，MALAT1 在OGD 期间和之后，也可见VEGFA和FGFb mRNA 和蛋白质的表达水平增加，进而促进BMEC血管生成，其对抗缺血性脑损伤的保护作用的潜在机制是通过miR-199a介导的[35]。

2.2.4 其他lncRNAs 除此之外，尚有部分lncRNAs充当miRNA海绵，作用于血管生成因子VEGF及Notch 等通路，参与脑缺血后血管生成的过程。SNGH1在OGD/R条件下，直接靶向吸附miR-199a，促进脑微血管内皮细胞存活和血管生成[36]。HIF1A-AS2则充当miR-153-3p的海绵，促进HIF-1α/VEGFA/Notch1级联的激活，上调HIF-1α，从而促进缺氧时HUVEC的活力、迁移能力和管形成[37]。NEAT1 通过靶向miR-377，上调VEGFA、SIRT1 和BCL-XL 的表达，从而促进了OGD诱导的BMEC的存活和血管生成[38]。

2.3 cirRNA 与脑梗死后的血管新生 环状RNA(cirRNA)是一类特殊的非编码RNA，近年来被证实在生物活动中发挥着重要的调控作用。基于基因芯片的生物信息学分析表明，脑缺血后大量cirRNAs异常表达，提示circRNAs和脑梗死后病理损伤和修复过程密切相关[39-42]。

2.3.1 cirRNA 参与脑梗死恢复过程 既往研究表明，circRNA 通过竞争性内源RNA(ceRNA)机制在疾病中发挥着重要的调控作用。据报道，circTLK1作为ceRNA 抑制miR-335-3p 的活性，导致神经元损伤。敲除circTLK1 可显著减少MCAO 小鼠脑梗死体积，减轻神经元损伤，并改善随后的长期神经功能缺损[43]。circDLGAP4 抑 制miR-143 活 性，从 而 导 致HECTD1 表达增加，而circDLGAP4 的过表达显著减少了MACO 小鼠梗塞面积并改善神经功能缺损[44]。circHectd1在MCAO小鼠脑和AIS患者血液中表达增加，其作为ceRNA抑制miR-142活性，导致TIPARP表达的抑制，进一步将其敲除后，可见tMCAO小鼠的梗死面积显著减少，神经元损伤减轻[45]。另有人体研究发现，circ Hectd1 的表达与脑梗死发病风险、严重程度、炎症和复发风险呈正相关[46]，这提示其是脑梗死疾病风险和预后的潜在生物标记。

2.3.2 cirRNA 参与血管新生过程 目前，circRNAs参与血管新生过程的机制研究不多，主要集中于肿瘤及病理性血管生成领域，例如通过HIF-1α信号通路参与Moyamoya病的血管生成[47-48]，通过激活VEGF/VEGFA等信号通路促进肿瘤血管生成和发展[49-50]。此外，也有大量研究发现，circRNA参与调节动脉粥样硬化、糖尿病的HUVECs 增殖、凋亡和血管生成基因的表达[51-53]。

3 临床转化的前景与挑战

如上所述，大量ncRNAs 被证实参与脑梗死后的血管新生过程，但是尚无相关临床转化研究，故而这些ncRNAs 是否可以作为脑梗死后的新治疗靶点，以及预后的生物标志物尚不清楚。尽管如此，根据现有研究，在开展临床转化研究前需要考虑如下因素。

首先，许多microRNA 和lncRNA 在神经元细胞，脑血管内皮细胞，小胶质细胞中差异表达，circRNA是否有同样的细胞特异性表达方式尚不清楚。其次，microRNA 和lncRNA 的表达因其不同的半衰期而具有时间依赖性，提示其作为中风患者的诊断或预后的生物标志物可能不太可靠，但是circRNA 因具有相对更长的半衰期，而使得它们可能成为用于中风诊断和预后的生物标志物的理想候选者。最后，已有动物研究通过慢病毒载体携带相关miRNA经颅入脑，促进血管生成从而改善神经功能缺损，但是这种方法因为安全性无法临床转化。因此，如何应对血-脑屏障对ncRNAs的阻滞作用也很关键。

总之，尽管面临各种挑战，但靶向调控ncRNAs仍然是脑梗死后血管新生的潜在治疗策略。随着对ncRNAs 调控机制的深入研究，相信在不久的将来可找到合适的调控分子，实现临床转化，并有机会发展成为脑梗死重要的治疗策略。