肿瘤干细胞对非小细胞肺癌放疗效果机制的研究进展

何环宇 姜笑 张琨明 杨育坤 王茂 李懿

近年来，由于环境和饮食等各种原因导致的癌症病例逐渐增多，同时因癌症导致的死亡人数也逐年增加。据中国国家癌症中心统计，2015年全国新增癌症病例392.9万例，癌症死亡病例233.8万例，肺癌已成为癌症相关死亡的最主要原因[1]。根据病理特征可将肺癌分为两大类：小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC），NSCLC约占所有肺癌患者的80﹪[2]。NSCLC 临床治疗的主要障碍之一是多数患者明确诊断时已为晚期，因此错过手术干预的最佳时机，而放疗则成为不可切除NSCLC的重要治疗方法[3]。但仍有20﹪患者因疗效不佳导致复发甚至死亡[4]。近几年，肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）理论已被广泛接受，由于CSC具备自我更新和无限增殖的能力，导致肿瘤细胞无法被完全根除，因此易造成肿瘤的残留与复发[5]。CSC在NSCLC放疗疗效中也起着重要作用，由于NSCLC中CSC的存在，可能通过如DNA 损伤修复，细胞保护性自噬等途径降低放射疗法的疗效导致预后不良。因此了解CSC 在肿瘤生物进程中参与放疗抵抗的机制有望为提高NSCLC放射治疗疗效提供新的依据。

一、CSC的起源和NSCLC中CSC的分离与鉴定

目前对CSC的起源尚有不同的观点，大致分为以下3种理论：（1）CSC起源于正常干细胞，该理论是基于如下假设：成熟细胞的有限寿命不足以积累发生致癌转化所必须的多重突变，而由于干细胞存活的时间足够长，可以获得形成恶性表型所必须的突变序列，利用已有的干细胞调控途径转化为CSC，以促进其自我更新[6]。正常干细胞中增殖过程受到严格调控，这些信号维持组织的稳态和再生，然而这样的调控平衡在CSC中转变成了由其自主调节的细胞增殖和分化信号；（2）CSC是由前体细胞发展而来。在组织中，祖细胞的数量比干细胞更丰富，这使得癌基因转化的可能性更大。祖细胞还具有少部分的自我更新能力[7]；（3）CSC是由分化细胞去分化而来。在这个理论中，致癌突变驱动去分化过程以及随后细胞的自我更新，意味着CSC可以从肿瘤细胞池内发展，并逐渐到达肿瘤细胞层次的顶端[8]。这一过程与分化的细胞产生上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）密切相关，EMT可导致干细胞样表型的获得和CSC的形成。

针对NSCLC，不同的研究报道了通过一些表面标记和分选技术从细胞系或新鲜肿瘤材料中分离出CSC。有研究者使用从临床患者手术后获得的NSCLC组织标本中分离得到的单个肿瘤细胞进行克隆形成实验，观察到部分醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）高表达的肺癌细胞具有克隆形成能力，因此间接证明了NSCLC组织中可能存在CSC 并且可以借助特定表面标记进行分离及鉴定[9]。Wang等[10]也报道了多个研究中利用CD133 等CSC 标记物分离鉴定得到肺癌细胞系中的CSC，并观察到肺癌患者不同细胞间的CD133 及ALDH活性与肺癌相关。另有多项研究也分别从SCLC和NSCLC细胞中分离得到人肺CD133+的CSC，并证明可以在特定条件下体外扩增为肿瘤球[11-12]。Xie等[13]也通过流式细胞分选等方法在人肺癌A549细胞株中分离鉴定出约1.09﹪为侧群细胞（side population，SP），与非SP细胞相比，其在体内具有更高的侵袭性和致瘤性及治疗抗性。Bagheri 等[14]研究还表明通过添加化疗药物筛选的方式也可以分离得到NSCLC 中的CSC，这些细胞表现出一些CSC 特征，如高克隆活性、SP细胞富集、干细胞标记物表达、自我更新能力、高致瘤性和分化后代的产生。因此更好地了解NSCLC 中所含的CSC 在肺癌中发挥的作用并确定可靠的标记物来分离肺癌中的CSC 对提高肺癌疗效有重要的意义。

二、NSCLC中CSC的免疫表型

由于CSC 只占整个肿瘤细胞群的一小部分，因此需要特异性的标志物来将其与普通肿瘤细胞及正常细胞区别开来。

（一）NSCLC中CSC相关的免疫表型

1.CD133：CD133是最常见的CSC 免疫表型，是一种细胞表面5个跨膜结构域和2个大的糖基化细胞外环构成的细胞表面糖蛋白，此前的研究已证明CD133 与NSCLC的复发与转移有明显相关性[15]。有研究者测试了大量肺癌患者的干细胞标记物，试图验证CD133+细胞具有CSC的特性，发现与SCLC 相比，CD133 在NSCLC 中的表达水平更高，且具有更高的自我更新能力、成瘤性和耐药性等特征，同时CD133表达水平与NSCLC的临床病理分期及不良预后密切相关[16]。CD133+肺癌细胞株H1650 中具有CSC 特性，这表明CD133可能是肺癌干细胞标志物[17]。就这一标记物的潜在意义而言，高CD133表达与NSCLC患者淋巴结转移及预后不良有关[18-19]。

2.ALDH：ALDH 由一组酶组成，可控制正常干细胞的分化，并在不同类型肿瘤对放化疗耐受的细胞亚群中高度表达[20]。ALDH1是一种胞质同工酶，是ALDH家族的一员，有研究表明高表达ALDH1的NSCLC细胞较对照组具有更强的致瘤性和克隆性[21]。ALDH1A1+的CSC 对化疗药物和表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）等肺癌治疗的常用药表现出耐药性[22]。另外有研究表明CD133 高表达与ALDH的联合作用，可能与NSCLC的治疗抗性及不良预后有关[23]。此外，在对大量NSCLC患者CSC 标记物的评估中，CD133和ALDH1的共同高表达与不良预后相关[16]。因此，检测患者CD133和ALDH的表达水平有可能成为评价NSCLC的预后指标。

（二）常见的CSC相关免疫表型

1.Nanog：已有研究证明Nanog 基因在胚胎干细胞自我更新过程中起着关键作用[24-25]。它在CSC中亦发挥类似的作用，由于其作用与CSC的这一关键表型特征直接相关，因此被用作肺癌CSC的标志物[26-27]。Nanog的过度表达与肺癌患者的不良预后有关，有研究已表明Nr5a2通过上调Nanog 转录水平，诱导肺CSC 特性并促进肺癌的发生发展，提示其可作为肺癌的预后指标[28]。另一项对72例不同治疗敏感性的肺腺癌组织标本的相关表面标记物检测中，也验证了耐药组的Nanog表达水平高于治疗敏感组，因此推测肺癌治疗中部分患者的后期耐药性增加与CSC 标记物Nanog等的表达增加呈正相关[29]。尽管已有部分研究对Nanog 与肺癌的相互关系做了探讨，但Nanog 与肺CSC 之间的关系仍有待更深入研究，以探讨Nanog是否有助于开发新的肺癌治疗策略。

2.SP细胞：SP细胞指能够排除Hoetsch 33242 染料的细胞群，其特征是具有自我更新、分化增殖、致瘤性和侵袭性以及表达CSC 标记和干细胞基因能力的细胞亚群[30]。肺癌SP细胞ABCG2表达增加，ABCG2 与SP细胞中Hoetsch 33242染料荧光信号的低存留率有密切的关系，同时表明肺癌SP细胞的百分比增加可能与肺癌的治疗敏感性有关[31]。这也被认为是分离CSC的有效标志物之一。

Nanog、SP细胞尽管未发现与NSCLC相关，但仍有充分证据表明其与肺癌相关治疗效果有明显相关性。

三、NSCLC中CSC影响放疗效果的机制

放疗是肿瘤治疗的重要手段之一，主要通过直接或间接造成DNA 损伤来发挥作用[32]，然后与大分子相互作用，导致DNA 损伤修复机制活化以及检查点的诱导以促进DNA 损伤修复[33]，若DNA 损伤无法修复，细胞内信号转导会诱导细胞凋亡[34]。而CSC 相较于普通肿瘤细胞具有更强的抗放疗抵抗能力，导致许多肿瘤患者对放疗耐受以及肿瘤复发，因此正确认识CSC 对放疗敏感性是何种关系对改进现有放疗方案及改良肿瘤患者预后有重要意义。

1.DNA 损伤修复和细胞增殖与凋亡：肿瘤的放疗抵抗主要是通过增强DNA 损伤修复能力来实现，有研究发现，ERK5可能会触发放疗诱导的细胞周期检查点激酶1（checkpoint kinase 1，Chk1）介导的DNA 双链断裂及细胞周期G2/M 阻滞有关，在敲减ERK5 基因后，肺癌A549细胞对放疗敏感性受到明显抑制，产生更强的凋亡反应，存活率明显下降[35]。Chen等[36]研究也证明NSCLC中Rad51c高表达的细胞表达CSC 特性，Rad51c可通过破坏放疗诱导的DNA 损伤来提高对放疗的杀伤抗性。类似的研究也证实Rad51和Exo1 介导的CD133 上调增加了DNA 双链断裂的修复能力，提高了CSC 样NSCLC细胞的放疗抗性[37]。针对NSCLC的研究也证实，CD133+CSC细胞在放射后富集，放射后存活率高于CD133-细胞，CD133+细胞内IL-6水平与CSC 免受细胞经放射诱导的DNA 损伤及细胞凋亡密切相关[38]。由于电离辐射对快速分裂和增殖的癌细胞有更好的杀伤效果，既往研究表明CSC的增殖速度比肿瘤细胞更慢，细胞周期中处于静止或休眠的细胞可能因未受损伤而导致肿瘤复发，在使用Chk1作为放疗增敏剂后可消除有放射引起的G2期阻滞，有效增加CSC 对放疗的敏感性[39]。另有研究证实了休眠细胞的主要特征：它们既不死亡也不增殖，而在静止一定时间后，开始增殖并显示出更强的克隆能力[40]。在接受放射治疗的患者中，CSC 休眠可能持续数年乃至数十年，这些静止细胞的增殖可以通过微环境的改变等来启动[41]。有研究发现休眠的肺癌细胞对EGFR 酪氨酸激酶抑制剂具有治疗抗性，敲减MIG6表达可以中止细胞休眠并增加肺癌细胞对治疗敏感性增高[42]。而在NSCLC中Chk1的激活抑制可以消除CSC细胞周期的增殖停滞，有效提高NSCLC的治疗敏感性，大大降低NSCLC细胞存活率[43]。此外细胞内较低的ROS 浓度可能在CSC中充当信使，并可能参与细胞周期调节和干细胞稳态[44]。还有研究发现，过表达miR-198可促进NSCLC细胞的增殖、迁移并诱导凋亡[45]。因此，进一步了解DNA损伤修复的机制及其与放疗后CSC增殖与凋亡的关系，有助于更有效地消除CSC提高放疗疗效。

2.自噬改变：自噬是一种受到精确调控的进化上保守的过程，通过溶酶体可以在很短时间内实现细胞内容物的大批量降解，使得细胞可以在应激情况下存活，维持细胞稳态。许多在NSCLC的治疗中常用的药物已被证明是通过诱导自噬以达到治疗效果[46]。细胞自噬水平升高，自噬相关蛋白如微管相关蛋白轻链3、自噬相关基因12 等表达增高，而人为抑制自噬水平可以降低细胞经历放疗后的存活率[47]。放疗是治疗肺癌的重要手段之一，虽然多数肺癌细胞对放疗敏感，但肺CSC的存在仍可通过肿瘤细胞自噬水平升高来介导NSCLC 对放疗敏感性降低。在既往的研究中已有提示经放疗诱导的A549 及H460细胞中自噬水平增加导致对放射线不敏感[48]。有研究表明由miR-191 水平下调介导的自噬活性上升促进了两种NSCLC细胞系A549 及H1299的放疗抗性[49]。另有研究发现，对肺癌细胞H1299 使用自噬抑制剂降低细胞自噬水平后，明显增强了放射线对H1299细胞的杀伤效果[50]。Wen 等[51]研究也表明ATG16L2 可能是NSCLC患者放疗后评价预后的预测指标。Chen 等[52]研究发现肺癌A549细胞中自噬水平的抑制导致Nrf2和Ho-1的表达下调，增加了放疗的敏感性。因此自噬水平与肿瘤的放疗敏感性呈负相关。

3.缺氧微环境：CSC 放疗抵抗的另一种机制是缺氧，氧气是一种有效的放疗增敏剂，是辐射诱导的ROS 产生以及细胞凋亡所必需的因素。众所周知缺氧会增加肿瘤对放疗的抵抗力，并且与放疗抵抗及放疗后早期复发有关[53]。缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是缺氧介导信号转导通路的重要调节因子，可以激活如Notch，Hedgehog 等途径[54]。缺氧会导致HIF信号传导途径的激活[55]。近年来已有研究表明HIF-1α参与肺癌的发生发展及预后，且与NSCLC细胞的顺铂耐药性有关[56]。既往的文献也证明HIF-1α通路在缺氧应激时可通过上调谷氨酸脱氢酶的表达来增加ATP的产生，从而增强肺癌细胞的耐药性[57]。He 等[58]对比NSCLC患者血浆中HIF-1α水平发现发现HIF-1α水平与NSCLC患者的生存率呈负相关。该现象的原因可能是高HIF-1α蛋白表达的肿瘤组织发生组织坏死，导致大量肺癌组织中的HIF-1α进入患者血液，抑或是由于NSCLC中CSC相关调节机制导致[59-60]。阻断HIF-1α可缓解低氧诱导的NSCLC浸润及治疗抵抗[61]。同时也有研究证实HIF-1介导缺氧诱导的NSCLC细胞的耐药性可以通过诱导氧化应激形成对抗，以增加NSCLC中CSC样细胞的治疗敏感性[56]。Yu 等[62]发现利用在异种小鼠模型上利用CoCl2诱导肺癌细胞缺氧微环境可以介导细胞因子表达上调增加肺癌细胞干性及治疗抗性。因此可推测肺癌进程中CSC是通过这些途径维持对放疗的抵抗性。

综上所述，CSC作为NSCLC 放射治疗过程中影响疗效的关键因素，通过增加DNA 损伤修复、改变细胞增殖速度、增强抗凋亡能力、自噬水平等途径增加放疗抵抗性，减少细胞凋亡，从而导致肿瘤的复发以及预后不良，而新技术的出现也使得鉴别和分离CSC的可能性不断增加，为肿瘤的放射治疗提供了新的思路，但目前仍有许多尚未解决的问题，深入加强对CSC的了解和认识，提高CSC的放疗敏感性，是需要进一步研究的方向，以便为NSCLC 放射治疗提供更好的方案。