间充质干细胞对新型冠状病毒肺炎免疫损伤潜在修复作用的研究进展

马瑞琪 吴涛 赵秀华 张久聪 于晓辉 张茜

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由一种新发现的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的肺炎，该病毒为具有外套膜的正链单股RNA病毒，其主要传播途径为呼吸道飞沫传播和接触传播,也存在粪口传播、母婴传播和气溶胶传播的方式，具有较高的感染性[1-3]。COVID-19的发病机制为SARS-CoV-2 通过表面S蛋白与宿主细胞上的受体结合进入宿主细胞，并形成新的病毒扩散[4]。近年来，已有多项研究证明间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在神经系统疾病、心血管疾病、肾脏疾病、糖尿病和自身免疫性疾病等治疗中有着广阔的应用前景和临床价值，对于COVID-19的治疗也显示出其不可替代的作用[5]。

一、SARS-CoV-2的致病机制

1.T淋巴细胞活化：目前缺乏T淋巴细胞在新型冠状病毒肺炎中具体作用的研究报告。由于该病毒与严重急性呼吸道综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）及中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）的相似性，可通过SARS的T淋巴细胞发挥作用的过程推测T淋巴细胞对SARS-CoV-2的作用[6]。SARS-Cov 首先感染气道上皮细胞，随后感染肺内存在的呼吸道树突状细胞（dendritic cell，DC），从感染的呼吸道上皮细胞裂解碎片中捕获SARS-CoV 抗原，在处理病毒的同时迁移到引流淋巴结，以MHC/肽复合物的形式将处理过的病毒成分提呈并激活部分初始T淋巴细胞。活化后的辅助性T淋巴细胞和杀伤性T淋巴细胞大量增殖并迁移到肺部感染部位清除病毒[7]。临床发现SARS-CoV-2感染患者外周血中淋巴细胞和T细胞减少原因未明，SARS患者也存在类似现象，在急性期辅助性及杀伤性T细胞都急剧减少，T细胞活化程度也降低。SARS 重症患者都存在T细胞应答延迟和持续性病毒感染，这提示重症患者可能出现了T细胞应答缺陷，导致机体抗病毒能力降低。目前尚未发现冠状病毒直接感染T细胞，但在SARS患者中，DC 功能和迁移能力受损可能是导致T细胞应答降低和数量减少的原因，应激反应也有可能诱导T细胞凋亡[8]。

2.炎症因子风暴：人体感染SARS-CoV-2后迅速激活CD4+T淋巴细胞，产生粒细胞-巨核细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、白细胞介素6（interleukin，IL-6）、IL-4、干扰素-γ（interferon，IFN-γ）等细胞因子形成炎症因子风暴，再激活炎症性T细胞（GM-CSF+IFN-γ+）和炎症性单核巨细胞（CD14+CD16+）等，这些活化的免疫细胞大量进入肺循环，发挥免疫损伤作用[9]；另一方面肺泡Ⅱ型上皮细胞正常情况下产生表面活性物质，抑制单核巨噬细胞的过度激活，SARS-CoV-2 通过刺突蛋白（spike protein，S蛋白）和Ⅱ型上皮细胞上的血管紧张素转化酶2（angiotensin converting enzyme2，ACE2）受体结合直接入侵该细胞，使Ⅱ型上皮细胞产生表面活性物质的能力丧失，单核巨噬细胞的激活完全失控[10]，与此同时细胞内的病毒RNA 通过水解酶产生的蛋白质结合，产生新的病毒，释放出原宿主细胞，继续侵入新的细胞，病毒快速复制和大量的促炎细胞因子、趋化因子反应破坏了肺微血管和肺泡上皮细胞屏障形成炎症风暴，导致血管渗漏和肺泡水肿，肺部炎症的加剧和弥漫性损伤，进一步引起大面积肺损伤，最终导致严重缺氧、进行性呼吸困难乃至呼吸衰竭。除肺外，因ACE2 广泛表达于人体组织，包括心脏、肝脏、肾脏、消化器官和脑组织等[11]，一旦病毒进入血液循环，就会广泛传播。然而，COVID-19的治愈主要取决于患者自身的免疫系统，当过度激活的免疫系统杀死病毒后，它会产生大量的炎症因子，导致严重的细胞因子风暴[12]，出现全身性炎症、血流动力学不稳定和多器官功能衰竭，甚至死亡。Huang 等[13]阐明，重症监护室COVID-19患者细胞因子和趋化因子的表达水平高于非重症监护室COVID-19患者，细胞因子风暴与疾病严重程度有关。因此，避免细胞因子风暴可能是治疗COVID-19的关键。

二、COVID-19治疗现状

截至目前，还未发现能够应对SARS-CoV-2感染的特效药物，且针对此疫情的疫苗也在紧张的研制中[14]。目前的一般治疗主要为支持治疗和抗病毒治疗，抗病毒治疗药物根据新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第7 版），推荐使用α-干扰素、洛匹那韦/利托那韦、利巴韦林、磷酸氯奎[15]。部分研究报道显示，瑞德西韦也具有抗冠状病毒的作用并可减轻病毒对肺部损伤[16]。对于危重症病例的治疗，除上述治疗外，加用更高级的生命支持治疗如体外膜肺氧合，还可使用肾脏替代治疗、血液净化和康复者血浆等治疗，此外对于某些IL-6 升高患者可试用托珠单抗免疫治疗等[15]。在此次疫情治疗中，我国传统中医药中的连花清瘟胶囊、疏风解毒胶囊等药物以及一些中药方剂对疾病的治疗也凸显出较好的疗效[17]。

三、MSCs 潜在治疗作用

MSCs广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，具有多向分化潜能和再生功能，因此最初的研究局限在分化方面，而后研究发现MSCs 具有强有力的免疫调节功能，可以通过炎症因子的诱导，调节固有免疫和适应性免疫应答，发挥免疫调节功能，因此，人们又将研究重点集中在炎症因子刺激MSCs的免疫抑制作用，减轻免疫病理损伤。当发生急、慢性炎症性肺部疾病，在炎症环境调控下MSCs 能够调节所有免疫细胞的增殖、活化和效应功能，抑制肺浸润性免疫细胞，减轻炎症反应。同时因MSCs的组织修复再生能力，故可向肺泡上皮细胞分化，为治疗临床上各种难治性疾病提供了一个新的治疗途径[18-19]。

1.免疫调节作用：MSCs 能够调节免疫性肺疾病中起重要作用的免疫细胞增殖，激活和效应子功能，包括专业的抗原呈递细胞（DC，巨噬细胞和B淋巴细胞），嗜中性粒细胞以及效应子和调节性T细胞。MSCs 通过旁分泌机制改变免疫应答[20]。MSCs 缺乏共刺激分子的表面表达，并且能够使Th1、Th2和Th17细胞无反应。另外，抑制性分子编程性死亡1（PD-1）与它的配体PD-L1和PD-L2的相互作用是MSCs 介导的T细胞增殖抑制的原因。MSCs可减少受伤的肺中效应T细胞的总数，并减轻Th1、Th2 或Th17 驱动的炎症反应，同时降低B细胞趋化因子和其受体的表达，从而降低炎症部位B细胞介导的免疫损伤[21-22]。此外有报道也关注到COVID-19患者的淋巴细胞减少和高水平的C反应蛋白。C反应蛋白是炎症和宿主对细胞因子特别是T细胞分泌的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNFα）、IL-6、单核细胞趋化因子（monocyte chemokines，MCP1）和IL-8 产生反应具有高度敏感性的生物标志物[23]，但是C反应蛋白本身不能成为干预的目标。MSCs 疗法可以通过改善微环境来抑制免疫系统的过度活化并促进内源性修复。通过静脉输注进入人体后，部分MSCs 会在肺中积聚，改善肺微环境，保护肺泡上皮细胞，防止肺纤维化并改善肺功能[7]。另外，MSCs 还可分泌可溶性免疫抑制因子前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、转化生长因子β（transformed growth factor，TGF-β）、吲哚胺2,3-二加氧酶（IDO）和一氧化氮（NO）等[24]。通过产生PGE2，MSCs 减弱了IL-2受体的表达，并因此抑制了活化T细胞的克隆扩增。TGF-β是IL-2信号通路的有效抑制剂，并参与了MSCs 介导的活化T细胞的G1细胞周期阻滞。以类似的方式，MSCs 衍生的NO抑制T细胞中信号转导子和转录激活因子-5（STAT-5）的磷酸化，导致细胞周期停滞，而MSCs 衍生的IDO 促进色氨酸降解为犬尿氨酸，从而抑制T细胞的凋亡。除了直接抑制效应T细胞外，MSCs 还可以通过调节PGE2、IL-10和IL-6中DC的抗原呈递功能来抑制Th1、Th2和Th17细胞的生成及依赖方式[25]。与MSCs 相互作用后，由于主要组织相容性复合体（MHC）和共刺激分子的表达减少，DC 变得不成熟，抗原呈递能力降低。另外，MSCs可以诱导DC中的耐受性表型，并且可以促进炎性M1 巨噬细胞向免疫抑制M2 巨噬细胞的极化。这样，MSCs可以减少DC和巨噬细胞中炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-12）的产生，并促进抗炎性因子IL-10和TGF-β的产生。以IL-10和TGF-β 依赖性的方式致耐受性DC和M2 巨噬细胞诱导MSCs中免疫抑制性HLA-G5的产生增强，增强其刺激T 调节细胞（Tregs）的能力，有助于在受伤的肺部创建抗炎微环境，明显改善了严重COVID-19患者的炎症情况。由于MSCs 独特的免疫抑制能力，使血清中促炎细胞因子和趋化因子水平显著降低，从而减少了脆弱肺组织对单核/巨噬细胞的吸引，同时诱导更多的调节DC 进入炎症组织生态位。而IL-10和VEGF的升高可促进肺的修复[26-27]。研究者对患者体内输入的MSCs作RNA 测序，发现其不表达SARS-CoV-2受体ACE2，此外，抗炎和营养因子如TGF-β、干细胞生长因子、纤维母细胞生长因子、血管内皮生长因子和神经生长因子等在MSCs中高表达，进一步证明了其免疫调节和保护功能[28]。

2.多向分化潜能：除了与肺浸润的免疫细胞相互作用外，MSCs 还具有在体外分化为Ⅱ型肺泡上皮（alveolar epithelial type Ⅱ cell，AT Ⅱ）细胞的潜力，这得益于MSCs在受损肺组织中的归巢，移入和存活能力。SARSCoV-2对正常肺结构的破坏促进进展性纤维化的发展，导致肺功能下降，表现为干咳、呼吸困难和疲劳。治疗肺中的MSCs 具有自我更新和分化能力,主动性归巢至受损伤肺组织中并发挥作用，减轻局部免疫损伤，促进局部细胞修复及调节免疫异常[29]。运用改良的小气道生长培养基中，Sutton 等[30]发现生长培养基中与MRC-5细胞（源自正常胎儿肺间充质组织）共同培养后，可以将骨髓来源的MSCs在体外成功分化为AT Ⅱ细胞。骨髓来源的MSCs与MRC-5 相互作用2～3 周后，AT Ⅱ样细胞在培养中占主导地位，并且在同一时间点，检测到了人类AT Ⅱ细胞的一种特定功能标记表面活性剂蛋白C。由于MSCs在体外可以分化成AT Ⅱ细胞，抑制降解酶的产生，抑制肺浸润免疫细胞中促纤维化因子的分泌。Liu 等[31]使用改良的共培养系统与鼠肺上皮12（MLE-12）细胞和SAGM 来证明Wnt3a诱导的经典Wnt/β-catenin 途径活化导致鼠MSCs在功能性AT Ⅱ样细胞中分化，该研究小组的成员证明，Wnt5a诱导的非经典Wnt/c-Jun N 末端激酶或Wnt/蛋白激酶C 途径的激活也可能导致MSCs 成功分化为AT Ⅱ样细胞体外。有研究观察到，通过静脉输入MSCs，可在呼吸机肺损伤后增强肺修复作用。Chimenti 等[32]证明了进行MSCs 预处理以防止大流量通气后发生呼吸机肺损伤的潜力，MSCs 预处理降低了肺水含量并提高了肺组织学评分，支气管肺泡灌洗液的蛋白质、中性粒细胞、巨噬细胞炎性蛋白2和IL-1β的水平也降低。Curley 等[33]观察到在高压呼吸机肺损伤模型中，气管内和静脉内递送的大鼠MSCs及其分泌物可相对增强肺氧合和顺应性的恢复，并恢复肺结构。同时测量IL-6和TNF-α 浓度也表明，MSCs 递送也显著减轻了炎症反应。最近，Hayes 等[34]发现MSCs在高压肺损伤后剂量低至每千克200万个细胞后仍保留其治疗功效。他们还观察到MSCs治疗的功效在损伤后6 h的情况下仍可维持。另外还发现MSCs可增强肺泡液清除率，这是ARDS恢复的重要过程。这可能由于巨噬细胞的吞噬能力增强以及在离体灌注的人肺炎模型中分泌的角化细胞生长因子的抗菌作用所致[35]。

3.胞外囊泡（extracelluar vesicles，EVs）的作用：现有研究表明，MSCs 分泌的EVs可能释放生物活性蛋白，脂质和核酸，从而促进机体受损细胞的功能变化[36]。在各种炎症性肺病实验模型中，通过转移MSCs 衍生的EVs可以抑制炎症过程并减少肺纤维化。在低氧性肺动脉高压的小鼠模型中，MSCs 衍生的外泌体的静脉内给药抑制了STAT3 信号传导，并恢复了miR-17和miR-204 超家族的水平，从而抑制了血管重塑和低氧性肺动脉高压。用MSCs 衍生的EVs 预处理的肺泡巨噬细胞可减轻LPS 损伤小鼠的炎症和肺损伤。如Li 等[37]报道，这种效应是由EV 介导的线粒体转移诱导的。一些证据表明，MSCs 衍生的EVs可以携带miRNA，这些miRNA 通过靶向PTEN和PDCD4 等促凋亡基因来减少肺组织凋亡和肺损伤[38-39]。在脓毒症的小鼠模型中，MSCs 不仅在体外而且在肺和肝组织中都将巨噬细胞极化促进为M2型。这些免疫调节特性是由外泌体miR-146a的释放介导的[37]。上皮和内皮细胞的凋亡增加了血管壁的通透性，使中性粒细胞浸润并加重了肺水肿和炎症。因此，通过MSCs 递送抗细胞凋亡的miRNA是减轻炎症的方法。MSCs-EVs可以将特定化合物传递给靶器官，这些化合物由MSCs 自身过度表达或可以直接加载到EVs中。而且，它们很容易进入体循环并维持持久的高浓度，而输注的MSCs 浓度迅速下降[40]。EVs 不会自我复制，从而降低了肿瘤形成的风险。Willis 等[41]发现，在MSCs 外泌体治疗后，巨噬细胞表型向抗炎M2 样状态转变，从而改善了肺功能、肺纤维化、血管重塑和肺动脉高压。

MSCs 有调节宿主对免疫损伤和感染的免疫反应以及促进组织免疫损伤后的修复能力在多个临床前模型中显示了其潜力，因此，在ARDS、肺炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病和肺间质纤维化的等多种肺部疾病治疗中已经被广泛研究。在近期面对SARS-CoV-2的免疫损伤，许多临床试验也指出MSCs的治疗是安全有效的，尤其是病情危重的患者，因为对于重症患者而言，最重要的是通过治疗来有效控制紊乱的免疫系统和修复损伤的组织。MSCs治疗可抑制免疫系统过度激活，通过改善微环境促进内源性修复。通过静脉滴注进入人体后，部分MSCs在肺内积聚，改善肺微环境，保护肺泡上皮细胞、防止肺纤维化进而改善肺功能。MSCs由于强大的免疫调控和修复功能无疑成为重症监护室COVID-2019患者治疗重要选择之一。