骨源性外泌体微小RNA对骨代谢的影响研究进展

郝 静，邓润智

外泌体为一种类脂质膜结合的细胞外囊泡，最早是20世纪70年代通过研究绵羊红细胞而发现的，其特指直径为40～150 nm，密度为1.09～1.18 g/mL的囊泡。外泌体参与各种体内的细胞活动，可以从包括唾液、尿液、精液、血浆、血清、母乳和羊水在内的多种体液中分离得到。在绝大多数哺乳动物细胞培养的培养基中也能够分离出外泌体，包括树突细胞、上皮细胞、肿瘤细胞、免疫细胞和干细胞等，其细胞产量每天约0.5 μg/106个。外泌体重要的生物学功能是与细胞间通讯有关，在细胞间传递蛋白质、mRNA和微小RNA(microRNA,miRNA)等。与外泌体相关的特征性标志物包括CD9、CD63、CD81、HSP70、HSP90、肌动蛋白和膜联蛋白等[1-4]。

骨骼系统基于不同来源细胞之间的通讯维护自身的稳定。成骨细胞和破骨细胞，分别对应着骨形成和骨吸收，在骨重塑期间协调这2种细胞的功能对于骨稳态十分重要。已知成骨细胞与破骨细胞之间存在3种信息沟通方式，分别是直接接触、旁分泌途径和沉积在骨基质中的生长因子。在成骨细胞与破骨细胞信息沟通过程中miRNA发挥重要作用。已经证明miRNA在骨细胞分化和功能中起关键作用，这些大量存在于成骨细胞和破骨细胞中的miRNA协调这2种类型的细胞在不同条件下维持骨稳态，从而影响骨发育。MiRNA除了在成骨细胞和破骨细胞的细胞内发挥作用，同时也通过细胞间的通讯发挥作用。最近，一些研究显示骨骼相关细胞，如破骨细胞、成骨细胞、骨细胞和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)均能够释放外泌体。同时研究也证实了在BMSCs和成骨细胞成骨分化过程中，细胞分泌的外泌体中有miRNA的存在，并且let-7a、miR-199b、miR-218、miR-148a、miR-135b、miR-203、miR-219、miR-299-5p和miR-302b随着成骨分化显著增加，而miR-221、miR-155、miR-885-5p、miR-181a和miR-320c在外泌体中显著降低。MiR-31在骨重塑的起始阶段对破骨细胞分化具有积极作用。此外，miR-146a对成骨细胞功能起促进作用，而对破骨细胞功能起抑制作用。在老年女性的骨质疏松骨折患者和卵巢切除小鼠中均发现破骨细胞的miR-214-3p表达显著增加。目前骨缺损修复重建的临床研究中关于细胞移植治疗是研究热点之一，但细胞毒性和免疫原性一直是困扰研究者的问题。研究发现外泌体不表达细胞表面主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ和MHC-Ⅱ，从而避免了细胞移植和治疗的缺点。同时，由于miRNA在细胞外空间中是不稳定的，外泌体可能为miRNA提供有效载荷，以保护它们免受RNases的降解、极端温度和细胞外环境中的pH值破坏，因此，miRNA通过外泌体转移以旁分泌的形式发挥作用是一种理想的作用形式[2,4-6]。作者主要围绕上述内容就骨衍生外泌体miRNA在骨重建中的作用作一综述。

1 外泌体miRNA对破骨细胞的调节作用

来源于BMSCs和成骨细胞前体的外泌体可以激活破骨细胞形成[2]，破骨细胞前体的外泌体具有促进破骨细胞分化成熟的能力。来自于破骨细胞的外泌体抑制破骨细胞生成，其机制在于来自破骨细胞的外泌体富集NF-κB受体激活剂(receptor activator of nuclear factor-kappa B，RANK)，而RANK能够抑制破骨细胞形成。RANK水平在破骨细胞衍生的外泌体中更高，并且去除含有RANK的外泌体能够明显减轻破骨细胞生成的抑制作用。因此，富含RANK的外泌体可能通过与NF-κB受体激活剂的配体(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL)竞争性结合，从而抑制破骨细胞中RANK信号通路的变化。也有研究发现，破骨细胞来源的外泌体中含有的miR-214可以使骨髓基质细胞中的巨噬细胞通过PI3K/Akt途径促进破骨细胞生成，因而破骨细胞外泌体含有的miR-214具有导致病理性破坏性骨病的作用[4,7]。

已证明来自成骨细胞的miR-503-3p外泌体可抑制RANK表达，同时也能够通过RANKL诱导的破骨细胞生成。有研究成骨细胞细胞系UAMS-32P释放的外泌体含有RANKL，能够激活RANK，从而诱导RAW264.7向破骨细胞分化。外泌体作为一种旁分泌调节剂发挥作用，介导成骨细胞和破骨细胞之间的通讯，这可能代表骨重建的一种新机制[4,8-9]。此外，miR-148a被发现在人BMSCs外泌体中上调，通过靶向MAFB基因促进破骨细胞分化，进而引起骨吸收[4,6]。

2 外泌体miRNA对成骨细胞的调节作用

来自矿化成骨细胞，以及破骨细胞和成骨细胞前体的外泌体均能够通过促进骨生成或促进破骨细胞生成而参与骨重建。起源于破骨细胞前体的外泌体能够激活成骨细胞分化，而破骨细胞衍生的外泌体能够抑制成骨细胞形成[7]。

矿化成骨细胞的条件培养基具有促成骨作用，早先认为其中可能是成骨细胞分泌的酶或生长因子发挥作用。进一步的研究表明，除了分泌的生长因子和细胞因子，成骨细胞分泌的外泌体也可能发挥作用。成骨细胞前体和分化的成骨细胞的外泌体中可以检测到let-7，具有增强骨生成的作用。破骨细胞来源外泌体中的miR-214-3p具有抑制成骨细胞骨形成的作用[2,7,10]。MiR-214被从破骨细胞外泌体中转移到了成骨细胞，它具有抑制成骨细胞体外分化和矿化活性的作用。破骨细胞特异性miR-214转基因小鼠的血清外泌体miR-214水平显著升高，能够通过ephrinA2/EphA2抑制成骨细胞活性[6-8,11]。

MiR-30d-5p和miR-133b-3p在成骨细胞衍生的外泌体中高度表达，通过靶向RUNX2基因来抑制成骨细胞分化。MiR-199b也参与了RUNX2介导的成骨细胞分化的控制。成骨细胞衍生的外泌体高表达miR-140-3p，通过抑制BMP2表达进而抑制成骨细胞的形成。此外，miR-335-3p，miR-378b和miR-677-3p在矿化的MC3T3-E1细胞中表达上调，通过抑制其靶基因而增强成骨细胞分化[6-7,11]。

3 外泌体miRNA对MSCs的调节作用

在MSCs成骨分化的过程中，细胞分泌的外泌体中miR-31表达显著减少，作为成骨的负调节因子发挥作用，其机制为miR-31通过下调RUNX2的下游因子成骨转录因子Osterix和SATB2来抑制成骨分化。而对MSCs中miR-31进行抑制，具有改善骨体积和骨密度的作用。MiR-21作为成骨分化的正调节因子，在MSCs成骨分化过程中表达上调，一方面，miR-21靶向成骨分化抑制剂Spry1和Sox2发挥作用，另一方面，miR-21调节PI3K-AKT-GSK3β途径，激活RUNX2的表达而增加MSCs的成骨[12]。

BMSCs成骨分化期间外泌体let-7a、miR-199b和miR-135b表达升高，miR-221表达降低；其中let-7可通过调节HMGA2抑制MSCs的脂肪化，进而增强骨生成和骨形成；miR-199b可能参与其中通过RUNX2控制干细胞的成骨分化。MiR-135b具有调节干细胞的成骨分化的能力，miR-135b的上调与多发性骨髓瘤患者MSCs成骨分化受损有关；miR-221的下调能够触发人类无限制体细胞干细胞和MSCs的成骨分化[13]。

4 外泌体miRNA的促血管生成作用

对于骨骼维持其骨量增长和发育时，必须通过形成新的血管或血管生成获得更多的氧和营养物质。MSCs来源的外泌体的质谱分析显示含有可溶性生长因子如血管内皮生长因子、转化生长因子β1、白细胞介素-8，能够刺激内皮细胞的增殖和迁移来加速促血管生成活性。除此之外，MSCs来源的外泌体含有miRNA，包括miR-210，miR-126，miR-132，miR-21和miR-6087，具有参与血管生成和诱导内皮分化的作用。来源于骨髓瘤细胞的外泌体富含大量miR-92a，在正常氧和缺氧条件下均有增强血管生成的作用。在慢性缺氧的条件下，多发性骨髓瘤细胞外泌体miR-135b也能通过靶向抑制低氧诱导因子-1改善血管生成[4,14]。

5 外泌体在骨相关疾病中的临床研究

在小鼠的骨折愈合模型中，MSCs衍生的外泌体注射能够增强骨折愈合。这一治疗策略在修复骨质疏松症老鼠中的临界骨缺损中同样有效，外泌体有效刺激BMSCs的增殖和成骨分化，并且效果随着外泌体浓度增加而增强。最近，也有学者将人胚胎MSCs衍生的外泌体用于治疗大鼠的软骨缺损，结果显示外泌体处理的软骨缺陷显示出增强的整体外观并改善组织学评分，到12周时软骨缺陷完全恢复[2,4,15]。MSCs分化晚期的外泌体miR-21表达显著上升，而在体内研究模型中也证实了miR-21具有增强骨质疏松症骨形成和加速骨折愈合的作用[12]。临床上，在骨质疏松症患者的血清和骨组织中发现miR-21、miR-23a、miR-24、miR-100和miR-125b均上调，表明这些miRNA可能是骨质疏松症诊断的生物标志物以及治疗靶标[16]。以上结果均提示了外泌体miRNAs在骨质疏松症中的作用。

6 展望

外泌体是天然存在的具有细胞特异性的纳米球，可以有效转运蛋白质的成分、miRNA、mRNA和其他细胞物质至靠近和远离细胞。骨外泌体内的特定物质提供了一种特定于细胞的机制，因此，骨衍生的外泌体可能适合用于骨再生和修复，具有调节成骨细胞、破骨细胞形成和分化的作用，与MSC相比，具有稳定性好、易保存、无免疫原性的特点，易于临床收集和使用，未来含有特定miRNA的骨衍生外泌体有望临床用于骨修复重建及骨代谢疾病的治疗[17]。