线粒体功能障碍在脊髓损伤疾病进展中的作用及机制研究*

周慧宇，崔帆，双卫兵

（1.山西医科大学 第一临床医学院，山西 太原 030001；2.山西医科大学第一医院 泌尿外科，山西 太原 030001）

脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是由于各种不同的致病因素引起的脊髓结构、功能损害，造成损伤水平以下运动、感觉及自主神经功能的障碍。严重影响患者及其家庭乃至整个社会的和谐。SCI 在全球范围内有着较高的发病率，一直是医学领域的研究热点［1-3］。按照时间进程，SCI 的病理生理过程可划分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段：前者大多是不可逆的损伤；后者是在原发性损伤的基础上继发性出现的病理生理改变，主要由氧化应激和炎症反应的级联放大效应所致［4-5］，损害多数可逆［6-7］，继发性损害阶段是SCI治疗的关键［8］。许多研究发现，线粒体功能障碍在SCI 的疾病进展过程中发挥了重要作用［9-13］。本文对SCI 后伤段脊髓组织细胞线粒体功能障碍的各种病理机制进行总结，以期通过对这些机制深入探索，寻找新的治疗SCI 药理学靶点。

1 概述

线粒体是所有真核细胞制造能量的细胞器，是细胞进行有氧氧化的主要场所，线粒体的氧化磷酸化可以满足细胞活动所需能量90%［14］。线粒体的氧化磷酸化过程主要通过内膜完整的呼吸电子传递链来完成［13-15］。在生理状态下，葡萄糖、蛋白质和脂肪等营养物质在细胞内水解为丙酮酸和脂肪酸后进入线粒体，并生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸递氢体（FADH2）等具有还原性的高能分子，这些高能分子通过氧化呼吸链逐级传递，生成水和二氧化碳，并释放能量。三磷酸腺苷（ATP）作为直接能源物质，为细胞各项生命活动的提供能量供应［16-17］。线粒体不仅是能量代谢工厂［18］，而且还参与多项细胞活动，如调节Ca2+浓度和诱导细胞凋亡等［19］。研究发现，SCI 后损伤段脊髓组织的细胞线粒体氧化磷酸化作用减弱，通过氧化释放能量并生成ATP 的效率显著降低［9-10］，而且损伤段脊髓细胞线粒体功能的恢复还具有一定的神经保护作用［11］。

2 SCI 后线粒体形态学改变

脊髓损伤段的细胞线粒体形态的改变，使能量代谢的结构基础遭到破坏，能量合成受限，从而加快脊髓的继发性损伤。透射电镜发现，在SCI早期伤段脊髓细胞的线粒体形态发生显著变化［20］。其在4、8 h 可以观察到线粒体体积明显增大，嵴排列不整或发生肿胀。随着时间的延长，在16 h甚至发现有部分线粒体膜产生破裂，出现空泡化。出现这种变化的原因是SCI 后促使Ca2+等进入线粒体，线粒体膜内外出现离子浓度差，在浓度梯度的作用下大量水分子进入线粒体内，造成肿胀。

3 SCI 后线粒体膜功能改变

线粒体的多种生理功能都依赖于膜的流动性。正常情况下，线粒体膜处于动态的平衡状态。颈髓损伤后受损细胞的线粒体膜磷脂酶A2（phospholipase A2,PLA2）活性在早期显著增高，伤后6 h 达到高峰，并且与代表线粒体膜流动性的η值升降幅度基本一致，提示线粒体膜流动性与PLA2活性具有相关性。这种情况可能是由于颈髓损伤早期PLA2活性增高，引起膜磷脂降解，从而导致线粒体膜流动性下降，这与早期的脂质过氧化反应密切相关［21］。受损细胞线粒体膜流动性的降低不仅会使Na+-K+-ATP 酶和细胞色素氧化酶的活性下降，还会损伤膜受体，使其不能发挥正常的生理功能，进而抑制了线粒体的能量代谢［22］。

SCI 后伤段脊髓细胞线粒体膜的改变主要体现在膜电位和膜流动性的下降。线粒体将所产生的部分能量以电化学势能形式储存于内膜，促使质子和其他离子在内膜两侧发生转移，最终由于他们的不对称分布而形成线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）。正常的MMP 对线粒体氧化磷酸化和ATP 的合成都至关重要，可以作为评价线粒体功能的重要指标［23-25］。MMP 下降不仅会使ATP 合成终止，还可以使胞质内的ATP 快速水解，从而加快ATP 的耗竭，能量供应严重不足［23］，加重脊髓细胞的损伤。

线粒体通透性转变孔道（mitochondrial permeablity transition pore,mPTP）在调节线粒体能量代谢、细胞凋亡和细胞坏死方面发挥了重要作用。mPTP 在生理状态下处于失活状态，从而保证线粒体内膜的低通透性，维持MMP 和膜内外的离子梯度，这对线粒体的能量合成至关重要。研究发现，SCI 后MMP 呈现下降趋势，脊髓损伤段细胞的mPTP 转变为开放状态［16，20，26］，其进一步导致电子传递和氧化磷酸化发生障碍［20］，游离脂肪酸增加、氧化应激以及Ca2+超载等［16，26］，阻断了ATP 的合成途径［20］。SCI 造成MMP 下降mPTP 开放后，细胞质中H+等小分子物质会透过线粒体内膜进入基质，引起内膜电位崩溃，氧化磷酸化完全脱偶联，ATP 合成终止；同时由于基质渗透压升高，线粒体明显肿胀，使外膜发生破裂，细胞色素c 以及其他凋亡诱导因子大量释放，进而激活Caspase 通路诱导细胞凋亡［16，26］。因此mPTP 或许可以成为防治SCI 疾病进展的一个新靶点。

4 SCI 后线粒体中Ca2+紊乱

细胞的各项生理功能都需要电解质平衡来维持，其中Ca2+的稳态尤为重要。SCI 后由于细胞膜损伤和Ca2+通道异常开放，细胞外大量Ca2+会发生内流；同时细胞内钙库的释放也会进一步提高Ca2+水平，最终导致细胞内发生Ca2+超载。而胞内Ca2+超载会造成Ca2+沉积于线粒体内［27］。研究发现SCI 6 h，脊髓损伤段的细胞线粒体中游离的Ca2+水平较对照组明显升高，随着损伤后的时间推移，尽管Ca2+水平呈现出下降的趋势，但是其线粒体内仍然维持着较高水平［9］。可见细胞内和线粒体内Ca2+超载是SCI 后线粒体功能障碍和结构受损的重要原因［28］。

线粒体膜损伤与细胞内和线粒体内高浓度Ca2+激活的磷脂酶有密切关系［27，29］。Ca2+超载对脊髓损伤段的细胞线粒体的破坏主要体现在以下几个方面［27，29-30］：①引起钙依赖性蛋白酶的活化，使核酸酶失去作用；②激活磷脂酶A 和磷脂酶C，催化膜磷脂水解，使细胞膜和线粒体膜结构遭到破坏，引起膜流动性降低、通透性增加；③诱导mPTP 开放，使线粒体发生肿胀、MMP 降低；④线粒体内发生Ca2+超载后会影响氧化磷酸化过程，使呼吸链电子传递发生障碍。以上这些变化均可导致线粒体能量代谢障碍，使ATP 合成减少，加重脊髓细胞的损伤。Ca2+、自由基和能量代谢可以相互影响，其中任何一方的异常都会诱发或加重另外两方的损伤［31］。

5 SCI 后线粒体中氧自由基损伤

氧自由基主要包括超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢及一氧化氮等。在生理条件下，氧自由基的产生和消除处于动态平衡，维持着神经细胞的正常功能［32］。然而有研究发现，在SCI 的4 h后，伤段脊髓细胞内氧自由基水平较对照组明显升高［33］。SCI 后氧自由基主要通过三个途径大量生成：由于局部组织缺血缺氧，伤段脊髓细胞的线粒体呼吸链电子传递发生障碍，NADH 无法进行氧化反应，造成大量堆积，过多的NADH 使膜脂质中的氧分子单价还原，产生氧自由基［21］；SCI后发生炎症应答，引起中性粒细胞活化，通过呼吸爆发产生了大量氧自由基［30］；同时补体活化和Ca2+超载也会引起氧自由基的增加［34］。氧自由基的大量生成，以及抗氧化防御系统的损伤，极易导致氧化应激的发生［35］。氧化应激是SCI 发病机制中的主要假说之一［36］，其不仅能使线粒体呼吸酶的活性降低，减慢呼吸链的电子传递，增加氧自由基生成，形成恶性循坏；其还可以通过增强解偶联蛋白的表达，产生质子漏，从而降低MMP，氧化磷酸化发生解偶联，最终使ATP 合成减少［16］。除此之外，氧自由基还可以通过脂质过氧化破坏脂质双分子层的完整性，使伤段脊髓细胞线粒体膜的流动性降低，通透性增加以及Na+-K+-ATP酶活性下降，进而引起受损细胞的能量代谢障碍［37-38］。目前临床使用的甲基强的松龙可通过阻断PGF-2α 途径，降低受损细胞的ROS 水平，减轻脂质过氧化反应，从而达到治疗SCI 的效果［10，39］，这也进一步验证了氧自由基对线粒体的损伤作用。

6 SCI 后线粒体中相关酶活性降低

线粒体正常的能量代谢需要多种酶的共同参与，这些酶活性的变化直接影响着能量代谢。Na+-K+-ATP 酶主要在ATP 的作用下通过转运Na+、K+，维持细胞膜内外正常的渗透压差，防止细胞水肿。SCI 后脊髓损伤段的细胞内Na+-K+-ATP 酶活性明显降低。研究发现，依达拉奉可增强Na+-K+-ATP酶活性，减轻细胞水肿，进而改善受损细胞的能量代谢，减轻继发性SCI 的疾病进展［40］。已糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶是糖酵解过程中的3 个限速酶，乳酸脱氢酶可催化丙酮酸转变为乳酸。研究显示，颈髓损伤后受损的脊髓组织细胞中这四种酶的活性均明显增高，表明有氧氧化和氧化磷酸化受到抑制，无氧酵解增强，细胞产能显著减少，由于无氧酵解在代谢过程发挥主导作用，故而大量乳酸在体内发生堆积，进而引起代谢性酸中毒，使细胞和组织再次受到损伤；此外，乳酸还可以抑制糖酵解，使能量产生进一步减少［41］。细胞色素C 氧化酶（COX）是呼吸电子传递链末端的酶，在细胞有氧氧化和氧化磷酸化偶联中发挥着重要的作用［42］，其活性的改变在一定程度上可以反映脊髓细胞的能量代谢情况［13，43］。超氧化物歧化酶（SOD）是位于线粒体内膜的一种抗氧化金属酶，能有效抑制氧化应激的发生［44］。研究发现，SCI 后伤段脊髓细胞中COX 和SOD 的活性均显著下降，提示能量代谢受阻［13］。白藜芦醇能够通过提高SCI 后伤段脊髓细胞中COX 和SOD 活性的表达，减轻氧化应激反应，改善能量代谢，且白藜芦醇具有安全有效、毒副作用小等优点，有望成为临床防治SCI 后的损伤进展的重要手段［13，45］。此外脊髓受损细胞中的柠檬酸合酶和ATP 合成酶的活性也在损伤后发生数量和功能降低，从而减少了ATP 的生成［46］。

7 SCI 后线粒体中线粒体DNA 突变

线粒体DNA（mitochondrial DNA,mt DNA）位于线粒体内膜基质侧，邻近氧自由基产生部位，而且缺乏保护蛋白和DNA 修复机制，因此在线粒体呼吸过程中产生的氧自由基易引起mt DNA 的氧化损伤，发生突变［47-49］。SCI 后由于伤段脊髓细胞中氧自由基大量堆积［33］，以及抗氧化防御系统严重损伤，mt DNA 发生突变的概率会大大增加。伤段脊髓细胞的mt DNA 突变后易损害基因组内重要的功能区，如氧化磷酸化酶基因密码区等，造成经转录和翻译形成的线粒体氧化磷酸化相关酶的功能受损，从而影响能量代谢。ATP 的生成减少，严重者可以导致细胞损伤及组织坏死［47，50］。而且mt DNA 突变可导致呼吸链功能障碍，会进一步增加氧自由基的产生，形成恶性循坏［47］。

8 SCI 后线粒体动力学改变

线粒体动力学是指线粒体不断进行移动、融合与分裂的过程［51］，与MMP 有密切关系［52］。线粒体动力学对细胞的能量合成有重要作用。研究发现，大鼠在SCI 3 h 后，伤段脊髓细胞的线粒体数目有所减少，而线粒体的截面积明显增大，ATP含量稍下降［53］；在12 h 后线粒体数目增多，线粒体的截面积变小，而ATP 含量明显下降，提示SCI 后脊髓损伤段的细胞线粒体出现了动力学改变，早期以融合为主，晚期以分裂为主［6，53］。SCI后早期线粒体的融合可以看作是一种代偿，能在一定程度上保证线粒体形态和功能的完整性，从而满足应急状态下细胞对ATP 的需求。因此，早期ATP 含量无明显变化，但随着线粒体损伤的加重，线粒体分裂增加，使线粒体处于失代偿阶段，从而ATP 含量发生明显下降。选择性线粒体分裂抑制剂-1 能有效抑制大鼠急性SCI 后脊髓损伤段细胞的线粒体分裂、改善MMP，从而使线粒体的能量代谢障碍得以有效控制［53］。

9 线粒体相关性细胞凋亡

脊髓损伤段的细胞线粒体发生能量代谢障碍后，可以通过一系列信号传导通路诱导细胞凋亡，其中最典型的是一磷酸腺苷（AMP）依赖的蛋白激酶（AMPK）信号通路。SCI 后脊髓损伤段的组织细胞能量合成受阻，ATP 生成减少，AMP、二磷酸腺苷（ADP）相对增多，而AMP/ATP 或ADP/ATP 比值的增高可激活AMPK。一方面，活化的AMPK 可以促进ATP 的生成；另一方面，AMPK也能激活其下游的p53 蛋白，诱导细胞表达Bax和Bak，进而使线粒体释放细胞色素c［54］。此外氧自由基引起的线粒体内膜的心磷脂过氧化，以及mPTP 的开放状态也可导致线粒体通透性增加，从而加速细胞色素c 进入到细胞质内［55］，最终细胞色素c 与凋亡蛋白活化因子结合，激活caspase，启动细胞凋亡程序［56］，进而加速SCI 的进展。

10 总结与展望

SCI 早期由于局部组织缺血缺氧，损伤节段的脊髓细胞的线粒体在形态和功能上会发生一系列病理生理改变，引起能量代谢障碍，最终导致继发性SCI 的范围扩大、程度加重。值得注意的是，造成伤段脊髓细胞线粒体功能障碍的众多因素或环节是相互作用，互为因果。目前临床尚无安全有效的方法帮助患者实现神经功能完全恢复［57］。甲基强的松龙是最早被批准用于SCI 治疗的药物，但是不良反应多，患者难以长久使用［58-59］。目前在亚细胞水平上的药物研发和机制研究已成为热门课题之一，线粒体在疾病中的作用也逐渐受到重视。研究发现，线粒体功能障碍与神经退行性疾病、肿瘤及脂肪肝等多种疾病发病相关［16］。目前针对SCI 后伤段脊髓细胞的线粒体功能改变已经开展了许多研究，但由于其机制复杂，不同环节间还存在着相互交叉，因此要达到保护脊髓功能的目的就需要从多个靶点和环节来防止线粒体功能障碍的发生。随着基因组学和蛋白组学研究的不断深入，SCI 后线粒体功能的致病机制将会被进一步阐明，因此通过改善伤段脊髓细胞的线粒体功能变化途径来治疗SCI 有着巨大的研究前景。