牛樟芝三萜类化合物的提取工艺及其检测方法研究进展

吴昊，郭美娟，王红，张岩，刘晓光，张兰天

（河北省食品检验研究院河北省食品安全重点实验室，河北石家庄050091）

牛樟芝（Antrodia camphorata）又名樟芝、牛樟菇、红樟芝、樟窟内菇，通常腐生于牛樟树上百年的树干空洞内，而牛樟树主要在海拔600 m～1 000 m以上地区分布，故牛樟芝是一种非常珍稀的药用菌[1]。牛樟芝子实体的形态特征非常多样，其子实体的表面多为红棕色、浅棕色或浅黄棕色。研究表明牛樟芝具有多种药理作用，如抗肿瘤、抗炎、抗氧化、免疫调节及保肝等作用[2-7]，也可用于治疗食物和药物中毒、腹泻、腹痛、高血压和皮肤瘙痒等[8]，其主要活性成分有三萜类化合物、多糖、马来酸和琥珀酸的衍生物、脂肪酸、泛醌类化合物等[9]，其中，三萜类化合物是目前牛樟芝子实体中发现最多的萜类化学成分，被认为是牛樟芝萃取物中苦味成分的主要来源。

目前专家学者从牛樟芝子实体及菌丝体中陆续分离得到的三萜类化合物多达40余种，其中仅牛樟芝所特有的三萜类化合物便有10多种[10-11]。牛樟芝三萜类化合物在抗肿瘤活性调节中扮演着重要角色，其具有抑制肝癌细胞的增殖、毒杀老鼠血癌细胞活性、抗血清素活性、活化神经细胞生长能力等功能[12]。试验证实，从牛樟芝子实体中提取的麦角甾烷型三萜类化合物对人类肝癌细胞、肺癌细胞以及乳腺癌细胞的细胞毒性均表现显著，并且对人类结肠癌细胞有着明显的协同毒害作用[13]。在链脲佐菌素诱导的高血糖糖尿病小鼠模型中，牛樟芝三萜类化合物能够减轻炎症反应，促进伤口愈合[14]。此外，三萜类化合物还对血管紧张素转换酶的活性有着显著的抑制作用，可以降低血压，防止高血压患者因血压过高导致脑血管破裂而中风[15]。

本文对牛樟芝三萜类化合物的提取工艺及其检测方法的研究进展进行综述，以期为牛樟芝三萜类药食同源产品的深入研究以及开发利用提供思路和理论参考。

1 牛樟芝三萜类化合物的提取方法

1.1 溶剂提取法

溶剂提取法是根据牛樟芝子实体和菌丝体中的各组分在溶剂中的溶解性质不同，选用对三萜类化合物溶解能力强，对其它组分溶解能力弱的溶剂，从而将三萜类化合物提取出来的方法。目前常用乙醇、甲醇或异丙醇溶液作为溶剂，对牛樟芝发酵液和菌丝体进行室温浸提、煎煮或加热回流提取，从而获得总三萜提取物。

1.1.1 室温浸提

作为较传统的提取方法，当前室温浸提法仍是获得牛樟芝总三萜的主要工艺手段。刘燕隔[16]在室温（20℃左右）下采用醇提法来制备牛樟芝菌丝体中三萜类化合物，将牛樟芝菌丝体粉末在75%乙醇、提取温度80℃、分离纯化时间1.5 h、料液比1∶40（g/mL）的条件下进行分离纯化，之后于4 000 r/min离心10 min，取上清液，便得到提取液。同时，诸多专家学者在优化室温浸提法提取工艺方面也展开了相关研究。韩金龙[17]选取95%甲醇、乙醇和异丙醇3种较常用的提取试剂对牛樟芝中的总三萜进行提取，发现乙醇的提取效果略高于甲醇，异丙醇的提取效果最差。黄红雨等[18]将响应面法应用于对牛樟芝总三萜提取工艺的优化，并根据单因素和响应面试验得出最佳提取工艺参数为：乙醇浓度78%、提取时间81min、料液比 1∶20（g/mL），在此条件下，牛樟芝总三萜提取率为5.26%。

1.1.2 热回流循环提取

热回流循环提取工艺是一种新型动态提取浓缩工艺，集提取浓缩为一体，其使用的装置是一套全封闭间歇循环动态提取装置。目前热回流循环提取法大量使用于规模化的工业生产中，具有生产方式简单、技术成熟度高、提取量大、生产成本低等优点[19]。王宫等[1]采用正交设计法确定了牛樟芝总三萜最佳回流提取工艺为3倍体积的95%乙醇回流提取3次，每次1 h，之后用氯仿溶解滤液，再用饱和NaHCO3溶液萃取4次，牛樟芝总三萜提取率达到10.02%。

1.1.3 超声辅助提取法

超声辅助提取法已在中草药提取和成分鉴定中取得一定的成果，超声波辅助提取三萜类化合物具有提取率高、时间短、提取成分完全、污染少、设备简单等优点。王光磊等[20]采用L4（23）正交试验法确定超声辅助提取法的最佳工艺条件为：樟芒与乙醇料液比1∶15（g/mL），在150 W功率下提取60 min。韩金龙[17]研究发现超声辅助提取牛樟芝总三萜的最佳工艺为：料液比 1∶100（g/mL），提取剂 95%乙醇，提取温度50℃，提取时间1 h，超声功率为300 W。吕莎等[21]通过星点设计-效应面法优化得到牛樟芝总三萜的最佳提取工艺为1∶20（g/mL）液料比用倍的90%乙醇超声辅助提取2次，每次40 min，超声功率400 W，在此工艺条件下，提取率可达11.87%。

1.1.4 微波辅助提取

作为一种新型提取方法，微波辅助提取法己在黄酮、皂苷、多糖、三萜等有效成分的提取中广泛应用。韩金龙[17]以95%的乙醇为提取溶剂，对比冷浸24 h，热回流6 h，超声1 h和微波10 min 4种不同方法，发现在较短的时间内微波辅助提取法的提取效果最优，并且以增加三萜提取量为目的确定了该法的最佳工艺为：萃取剂二氯甲烷、提取剂90%乙醇，料液比1∶51（g/mL），时间 9.5 min，温度 65℃，功率600 W，在此工艺下三萜提取量可达到7.65 mg/g。但微波辅助提取法的处理量很小，从而限制了其在工业生产中的规模化应用。

1.2 超临界流体萃取法

超临界流体萃取法是一种新型提取分离方法，在近常温条件下便可实现对不同极性、不同沸点化合物的提取分离，在提取分离过程中，原料的有效成分几乎可以被全部保留，同时无有机溶剂残留。该法操作简单并且节约能源，通过超临界流体萃取法获得的产物纯度和提取率均较高。近几年，该法发展较快，在萜类物质提取方面的应用日渐增多，马礼金等[22]曾用超临界流体对红芝及其孢子中的三萜类化合物进行提取。但超临界提取所需设备价格昂贵，成本较高。

2 牛樟芝三萜类化合物的检测

牛樟芝三萜类化合物的检测分析方法现在已经基本成熟，主要有重量法、比色法和色谱法。此外，通过充分利用新技术，专家学者还在不断建立新型的快速检测方法，如Rao等建立的高效液相色谱-二极管阵列检测法，该方法能够同时测定牛樟芝中10种三萜类化合物成分，能够成功实现对牛樟芝子实体和菌丝体中三萜类化合物的定性和定量分析[23]。

2.1 牛樟芝总三萜的检测

2.1.1 重量法

根据三萜类化合物的极性，采用水和氯仿（或乙酸乙酯、正丁醇）对牛樟芝进行分离萃取，有机相分离浓缩后得到的物质即为总三萜，采用此法对总三萜进行测定即为重量法[24]。重量法较为简便，应用较为广泛，但是由该法所得总三萜的纯度不高。

2.1.2 比色法

牛樟芝中总三萜的检测一般采用分光光度法，该方法具有灵敏度高、准确度好、结果稳定、重现性佳的优点。目前应用较为广泛的比色法主要是香草醛-高氯酸法[25-26]，即利用三萜类化合物在加热条件下可与香草酸和高氯酸发生显色反应，将三萜类化合物在550 nm下的吸光度按照齐墩果酸标准液制作出的标准曲线进行计算，可以确定牛樟芝中总三萜的含量[27]。此外，也有相关研究是依据熊果酸标准液制作出的标准曲线来测定牛樟芝总三萜含量[18]。除了香草醛-高氯酸法，有研究采用硫酸乙醇显色法来测定提取液中三萜类化合物的含量，但样品中的干扰物质对这两种方法都有较大影响。

2.2 牛樟芝三萜类单体成分的检测

目前用于牛樟芝三萜类单体成分的分析检测方法主要有光谱学、生物学及色谱学方法，其中，以色谱学方法应用最为广泛。用于牛樟芝三萜类单体成分检测的色谱法主要包括薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法及其与质谱联用等方法。

2.2.1 薄层色谱法

薄层色谱法属于吸附色谱法，该法兼备了柱色谱和纸色谱的优点，是一种微量、快速、简单、分离能力强的方法，近年来已被成功应用于定量分析三萜类单体成分。但是薄层色谱法在三萜类化合物的测定方面仍存在一定的缺陷，如该法不适用于总三萜含量分析，同时其分析准确性、重现性和选择性较差，因此一般只能采用该法做半定量或限度试验。张寅等[28]运用薄层色谱-分光光度法排除脂肪等物质的干扰对牛樟芝菌粉中的总三萜含量进行了检测。韩金龙[17]将牛樟芝总三萜粗提物经分离纯化后进行薄层色谱分析，并以齐墩果酸为标准品，得到的薄层色谱与标准品的位置和颜色均接近。Chen等[29]利用薄层色谱对不同生长阶段的红色和白色牛樟芝中的三萜类物质进行分析，发现不同菌种、不同生长阶段其三萜类物质存在差异。

2.2.2 气相色谱法

气相色谱法具有灵敏度高、准确度高、重现性好等优点，但该法要求化合物具有一定的挥发性，而大多三萜类物质的挥发性较差，因此采用该法进行定量分析时往往需要将三萜类物质进行衍生化处理后才能进行检测，这使得该法的应用在一定程度上受到了限制。

2.2.3 高效液相色谱法

高效液相色谱法常被用于三萜类物质的定性定量分析，该法具有分析范围广、速度快、分离效能高、分析高效、高分辨率、高灵敏度等优点[30]。但是该法一般是以极少数的几种三萜为标准品，相应地测定原料中某几种三萜的含量，而对于总三萜含量的测定仍存在困难。将牛樟芝总三萜粗提物经酸碱沉降和萃取洗涤分离纯化后，在最佳流动相为甲醇∶水=90∶10（体积比）的条件下进行高效液相色谱分析，可以得到与标准品相对应的相对保留时间和峰面积[17]。

2.2.4 液质联用色谱法

液质联用色谱法具有低耗样量、低流速、分析范围广、线性范围宽、灵敏度高、特异性强、分析时间短等其他方法所不可比拟的优势，这些优势可以克服分析中三萜类化合物成分复杂、基质抑制效应显著、吸收性强的困难。徐萌萌[31]采用超高效液相色谱-质谱联用法对牛樟芝胞内三萜类化合物进行分离鉴定，共鉴定出6种羊毛甾烷类物质，依次为3β，15α-二羟基羊毛甾-7，9（11），24-三烯-21-酸、3β，15α-二羟基羊毛甾-8，24（28）-二烯-21-酸、去氢硫色多孔菌酸、去氢齿孔酮酸、齿孔酸，这些物质均具有很好的生物活性。

2.2.5 近红外光谱法

近红外光谱法是一种新型的绿色分析方法，具有准确、快速及非侵入式分析等优点，该法已广泛应用于食品和药品的定性及定量分析。近红外光谱是电磁辐射波的一种，波长范围是780 nm～2 500 nm，与分子中C-H、O-H、N-H和S-H基团振动的合频以及各级振频相关。以齐墩果酸为标准品进行近红外光谱分析，与标准谱图对比，特征峰基本一致，将分离纯化后的牛樟芝三萜物质进行近红外光谱分析，得到谱图中的特征峰与标准谱图的基本一致[17]。初秋博等[32]应用近红外光谱结合化学计量学方法建立牛樟芝菌丝体样品中多糖和三萜组分的定量分析模型，能够快速、准确和无损地对牛樟芝及其诱变菌株的菌丝体样品的有效成分进行定量分析。

3 结语

近年来，牛樟芝得到了诸多关注，同时国内外的专家学者也对牛樟芝中三萜类化合物的结构成分、提取方式及检测方法进行了广泛、深入研究。随着技术的飞速发展，牛樟芝中三萜类化合物的提取工艺和检测方法都在不断改进，只有充分利用新工艺新技术新方法才能使牛樟芝三萜类化合物的研究更加便捷、深入地开展，才能真正实现对牛樟芝三萜类药食同源产品的研究开发。