环境样品中有机锡类环境激素检测方法研究进展

胡红美，王 姮，应忠真，孙秀梅，李铁军，金衍健，张 博

（浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316021）

有机锡化合物（organotin compounds，OTs）常被广泛用作聚氯乙烯稳定剂、船体防污材料、木材防腐剂、杀虫剂、杀菌剂，具有高毒性和相对持久性，是环境中备受关注的有机污染物[1]。其中，用于船只防污涂料和杀虫剂的三丁基锡（TBT）和三苯基锡（TPhT）在水和沉积物中低浓度（甚至不足1 ng·L-1）时就可以对水生生物产生高毒性，导致海洋腹足类生物发生性畸变和破坏内分泌系统[2-4]，目前许多国家已将TBT、TPhT 及其降解产物列于优先污染物的黑名单中，国际公约规定2008 年起所有运营船舶不得含有此类涂料。但有机锡半衰期较长，全球范围内环境中OTs 的污染仍然十分严重。特别是1977-1983 年，在法国阿卡琼海湾，由于TBT 的干扰造成长牡蛎Crassostrea gigas 贝壳畸形，使当地的经济损失达8.8 亿法郎[5]。自此，世界各国对有机锡化合物（主要是TBT 和TPhT 等）污染进行了研究，内容主要涉及OTs 的分析检测方法、环境化学行为、性畸变、生态毒理学以及健康风险等领域。在欧盟，目前并没有就沉积物中的TBT 达成一致的环境质量标准（EQS），然而，《水框架指令》（WFD，2000/60/EC，2008/105/EC）将未经过滤水的EQS 设置为0.2 ng·L-1（平均允许浓度）和1.5 ng·L-1（最大允许浓度）。根据2009/90/EC《化学分析和监测水质技术规范》，检出限为50 pg·L-1，但很少实验室能达到[6-7]。

近年来有机锡检测方法已取得了重大进展，目前常用的检测方法主要有气相色谱-火焰光度检测法（GC-FPD）、气相色谱-脉冲火焰光度检测法（GC-PFPD）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、气相色谱串联质谱法（GC-MS/MS）、气相色谱-电感耦合等离子体质谱法（GC-ICP-MS）、高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS）、超临界流体色谱-电感耦合等离子-质谱法（SFCICP-MS）等，且这些方法通常还需要结合液液萃取（LLE）[8]、固液萃取（SLE）[9-11]、索氏提取（SE）[12]、超声波萃取（USE）[14-19]、微波辅助萃取（MAE）[20-22]、加速溶剂萃取（ASE）[23-25]、固相萃取（SPE）[9-11，13-14，22-23，26-27]、固相微萃取（SPME）[16-17，28-31]、液相微萃取（LPME）[16，32-33]、搅拌棒吸附萃取（SBSE）[18-19，34-36]、超临界流体萃取（SFE）[37]等多步前处理。当采用气相色谱分析时，还需要进行衍生。本文将从样品前处理方法和环境样品中OTs 检测方法两方面进行详细的对比分析和系统的论述，为今后环境样品中OTs 的分析提供技术支持。

1 前处理方法

环境样品种类较多，基质复杂，当采用气相色谱联用技术时，样品前处理主要包括萃取、衍生和净化三个步骤；而采用液相色谱联用技术等其他方法时，只需要萃取和净化。

1.1 萃取方法

有机锡的萃取方法已经从传统的LLE、SLE 和SE 方法发生了重大变化，这些方法提取过程耗时、工作强度大，而且使用大量有毒溶剂。USE、MAE、ASE 因具有快速、可批量处理，溶剂消耗少等优点，已成为更普遍的方法[38]。SPE 因其普遍适用性而得到广泛应用，其预浓缩系数往往高于其他常规技术[39]。SPME 和LPME 因其灵敏度高、有害溶剂用量少，以及可以同时进行原位在线萃取和衍生化而受到人们的广泛关注[40]。SBSE 与SPME 类似，但富集倍数比SPME 提高了50～250 倍[15]，然而，对于目标分析物，还必须优化萃取和洗脱条件（例如样品pH、搅拌速度和温度）。

1.1.1 溶剂萃取

溶剂萃取是用萃取剂提取与之互不相溶的双组分或多组分溶液，实现组分分离的传质分离过程。常用的萃取剂有正己烷、乙腈、甲醇、二氯甲烷、盐酸-甲醇（v/v，1：1）、醋酸-甲醇（v/v，1：1）、正己烷-环庚三烯酚酮等。袁玲玲等[8]在海水中加入盐酸、NaDDTC 溶液，用200 mL 二氯甲烷分别萃取两次，再用四乙基硼化钠（NaBEt4）乙基化衍生，GC-MS 法检测9 种OTs，回收率为76%～102%，RSDs 为1.24%～13.4% （n=3）。WANG Xiaomeng，et al[9]采用盐酸-甲醇（v/v，1：1）固液萃取，提取液再用正己烷-环庚三烯酚酮浸提，Grignard 试剂烷基化衍生，弗罗里硅土柱净化，GC-FPD 法检测沉积物中丁基锡，回收率为98%～119%，RSDs＜15%，检出限为0.2～0.7 ng·g-1。CUI Zongyan，et al[11]采用正己烷-环庚三烯酚酮固液萃取、n-PrMgBr 试剂烷基化衍生、硅胶-弗罗里硅土串联柱净化，GC-MS/MS 法测定海产品中丁基锡和苯基锡，检出限为0.5 ng·g-1（干重），回收率为70.5%～133.5%，RSDs 为0.5%～12.5%。

1.1.2 超声波萃取（USE）

超声波萃取（USE）是由溶剂萃取和超声波结合形成的萃取技术，主要利用超声波的空化作用来增大物质分子的运动频率和速度，从而增加溶剂的穿透力，提高被提取组分的溶出速度，即超声波的存在提高了溶剂萃取的效率，主要用于沉积物和生物体中OTs 的萃取。LEE，et al[14]以鱼类、贝类、海产品为研究对象，环庚三烯酚酮-甲醇-盐酸为萃取剂，采用USE、Grignard 试剂烷基化衍生，弗罗里硅土柱净化，GC-MS 法检测丁基锡和苯基锡，回收率为60%～140%，检出限为4～8 ng·g-1。PRIETO，et al[19]分别以含Dowex M-41阴离子交换树脂的盐酸溶液和10% （m/v） KOH-甲醇溶液为萃取剂，经过USE、HS-SBSE、NaBEt4 乙基化衍生、热解吸-GC-MS 法检测一丁基锡（MBT）、二丁基锡（DBT）、TBT，沉积物中检出限为27～42 pg·g-1，生物体中为14～32 pg·g-1。

1.1.3 微波辅助萃取（WAE）

微波辅助萃取（WAE）是利用微波能加热与样品相接触的溶剂，将目标化合物从样品基体中分离出来并进入溶剂，是传统溶剂萃取基础上强化传热、传质的过程，即微波能的存在提高了溶剂萃取的效率，主要用于沉积物和生物体中OTs 的萃取。但微波萃取对温度要求高，温度过高时会破坏有机锡样品的稳定性。HASSAN，et al[20]以海洋沉积物为研究对象，乙酸乙酯-正己烷为萃取剂，在85 ℃下微波辅助萃取30 min，再经过Grignard 试剂烷基化衍生、GC-MS 法检测6 种OTs，检出限为18～40 ng·g-1（干重）。FLORES，et al[21]采用WAE、NaBEt4乙基化衍生、GC-MS 法检测沉积物中MBT、DBT、TBT，分别比较了不同萃取剂，在100 ℃200 W 条件下微波辅助萃取4 min 的萃取效率，结果表明，酒石酸-甲醇为萃取剂时，萃取效率为45%～73%，检出限为36～116 ng·L-1；醋酸-甲醇为萃取剂时，萃取效率为60%～100%，检出限为42～52 ng·L-1。

1.1.4 加速溶剂萃取（ASE）

在传统溶剂萃取基础上，近几年发展的ASE，是指在温度50～200 ℃、压强10～15 MPa 的条件下，利用有机溶剂对固体或半固体样品进行萃取的技术。CHIRON，et al[23]等采用ASE 法测定沉积物中丁基锡和苯基锡，使用Dionex ASE 200 萃取仪，甲醇-乙酸-环庚三烯酚酮为萃取剂，萃取温度100 ℃，5 次循环，萃取液经C18 固相萃取净化后，进行HPLC-ICP-MS 分析，回收率为72%～102%，RSDs 为8%～15%，检出限为0.7～2 ng·g-1。NICHOLS，et al[24]采用ASE、HPLC-MS/MS 法测定海洋沉积物中三丁基锡，萃取剂为甲醇-乙酸，萃取温度为100℃，压力为1 500 Pa，检出限为1.25 ng·g-1。ANTIZAR-LADISLAO，et al[25]采用ASE、NaBEt4乙基化衍生、GC-MS 法测定海洋沉积物中丁基锡，萃取剂为甲醇-乙酸，萃取温度为100℃，压力为1 500 Pa，回收率为（72.4±5.0）%～（80.5±2.6）%，检出限为1.00 ng·g-1。采用与传统溶剂萃取法相比，具有萃取效率高、耗时短、溶剂用量少，自动化程度高等优点。

1.1.5 固相萃取（SPE）、固相微萃取（SPME）、液相微萃取（LPME）、搅拌棒吸附萃取（SBSE）

SPE 常用于水样中有机锡的富集萃取。C18 是最常用的吸附剂（无论是萃取柱还是萃取膜）。其他吸附剂如石墨化碳黑、C2、C8 和阳离子交换相等使用较少。在线SPE 结合HPLC 是一个有吸引力的选择，它可以减少分析时间、劳动力成本和基质效应。据报道使用在线C18 SPE 和HPLC-MS 联用技术检测水体中TBT 和TPhT 时，回收率为81%～102%，RSDs 为5.0%～13.1%，检出限为20 ng·L-1（3.0 mL 水样）[27]。离线SPE应用也受到了关注。如利用分散分子印迹聚合物（MIPs）原位提取萃取液中的MBT、DBT、TBT、TPhT，再通过HPLC-ICP-MS 检测，检出限为0.006～0.02 ng[41]；利用Fe3O4 和分子印迹模板从萃取液中分离出TBT，再通过HPLC-MS/MS 检测，回收率为78%～96%，检出限为1.0 ng·g-1[42]。

SPME 主要在SPE 基础上发展而来。SPME 可以使用直接浸入式（DI-SPME）或顶空模式（HS-SPME），通常使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为萃取头。萃取剂的pH、温度和搅拌条件需要优化，以便有效地将有机锡吸附到SPME 萃取头上；随着自动取样设备的投入，可以自动进行（在线提取、衍生和解吸分析物到GC进样口）。对于HPLC，需要一个特殊的解吸室来允许流动相进入SPME 萃取头。但SPME 易受样品基质干扰，且萃取头昂贵，但TBT 的检出限可低至0.025 ng·L-1[43]。LPME 是LLE 的一种改进，因其使用溶剂少，萃取速度快，选择性高，浓缩倍数高而备受关注。LPME 在有机锡萃取富集方面的工艺主要包括分散液液微萃取（DLLME）[32]、顶空单滴微萃取（HS-SDME）[15]和直接浸入单滴微萃取（DI-SDME）[34]，结合GC-MS，或GCICP-MS，或GC-MS/MS 检测水体中OTs 时，检出限范围为0.4～3.0 ng·L-1。

SBSE 可以直接放置在水样中，通过持续的选择性吸附，达到富集待测组分的目的，极大的提高了分析灵敏度。据报道，利用PDMS 搅拌棒和二维气相色谱-串联质谱（GC×GC-MS/MS）或LC-MS-MS，海水中丁基锡的检出限为0.01～0.8 ng·L-1[35-36]。商业上可用的SBSE 吸附剂涂层以前仅限于PDMS，目前还出现C18吸附剂[18]。

1.2 衍生

使用GC 联用技术检测时通常需要进行衍生。有机锡的衍生主要包括使用Grignard 试剂或烷基硼酸盐（通常是NaBEt4）进行烷基化，或使用硼氢化物（如硼氢化钠NaBH4）进行转换。NaBEt4由于其在水相基质中的应用，以及具有在线和离线同时衍生和提取的功能，是最常用的试剂[15]。相较而言，Grignard 试剂，因需要专业的处理技术和干燥条件，以避免与水、酸、酮和醇发生反应，不太受欢迎[44]。NaBH4氢化衍生反应剧烈，易产生大量气泡，带走氢化的有机锡，重现性较差，而NaBEt4的衍生更简单，在水相中可将有机锡转化为它们的乙基衍生物。不过衍生时必须调节pH 值（pH 4～6），使乙基可以亲核取代有机锡阳离子。NaBH4可以与水相基质同时进行衍生和提取，但是，由于这些有机锡衍生物的挥发性，可能会发生损失。NaBH4可能受到复杂基质（如生物和沉积物）的干扰，主要来源于与金属的相互作用以及金属硼化物的产生（抑制有机锡化合物上Sn H 键的形成）[15]。由于上述衍生过程的稳健性，对替代试剂的研究很少受到关注，目前研究者更感兴趣的是开发自动化联机方法，以促进一致性和减少劳动力成本。

1.3 净化

为减少样品基质及衍生带来的杂质干扰，在仪器分析前通常需要净化处理。主要采用层析柱或商品化固相萃取小柱进行SPE 净化。常用的净化柱有弗罗里硅土柱[9，13-14，22]、硅胶-弗罗里硅土串联柱[11]、C18 柱[22-23]等。小柱中的吸附剂通过极性、疏水等相互作用选择性地保留物质，再通过淋洗液选择性地把目标物质洗脱下来，达到对样品净化的目的。常用的淋洗液有环己烷[13]、正己烷[9]、正己烷-甲苯（v/v，1：1）[14]、甲醇-水-醋酸（v/v/v，72.5：21.5：6）[23]、丙酮[22]、正己烷[11，22]、含5%乙醚（v/v）的正己烷[22]等。

此外，也有报道采用凝胶渗透色谱（GPC）、硅胶柱SPE 或弗罗里硅土SPE 联合净化。沈海涛等[45]建立了一种溶剂萃取、GPC 净化除脂肪、NaBEt4乙基化衍生、硅胶柱进一步除杂、GC-MS 法测定水产品中三丙基锡（TPrT）、TBT、TPhT，回收率为76%～113%，RSDs 为4.28%～9.14%，检出限为0.33～0.97 ng·g-1。吕华东等[46]采用振荡萃取法，以GPC 净化浓缩液，用戊基溴化镁衍生，衍生物经弗罗里硅土SPE 进一步净化后，用GC-PFPD 测定，以内标法定量，建立了鱼贝类水产品中8 种OTs 的分析方法，回收率在82%～104%之间，RSDs 为1.4%～13.3%，检出限为1.00 ng·g-1。

2 检测方法

2.1 气相色谱法（GC）

GC 技术是分离OTs 最常用的方法，它具有较高的分辨率和多种灵敏的检测器可供选择，如原子吸收光谱法（AAS）、FPD、PFPD、MS、MS/MS、ICP-MS、微波诱导等离子体原子发射检测器（MIP-AED）等。当采用GC-AAS、GC-FPD、GC-PFPD、GC-MS、GC-MS/MS、GC-ICP-MS、GC-MIP-AED 测定丁基锡和苯基锡的仪器检出限分别为40～95 pg[47]、0.2～18 pg[47]、0.07～0.48 pg[48]、0.1～10 pg[47]、0.20～0.35 pg[49]、0.012 5～0.17 pg[47，50]、0.01～0.03 pg[47]。常用的气相色谱柱为非极性柱（如5%苯基甲基聚硅氧烷固定相），一次可分离不同的有机基团（丁基、苯基、丙基）[51]。典型的柱长25～30 m，内径0.25 mm，固定相膜厚度0.1～0.3 μm。通常采用不分流进样（1～5 μL，250～280 ℃）。其他的注射技术，如柱上进样和程序升温蒸发-大体积进样（PTV-LVI）可以用来改善灵敏度[52]。PTV-LVI 是一种在线溶剂蒸发技术，在该技术中，较大的进样量（10～100 μL）在进样口蒸发。但早期洗脱化合物（如乙基化MBT 和TPrT）的丢失可能会带来问题，该方法需要仔细优化。用于冷却入口（＜20 ℃）的低温装置可以提高早期洗脱化合物的保留率。样品运行时间从10～40 min 不等，这取决于分离出的分析物的质量范围和衍生步骤中生成的有机物类型。

2.2 高效液相色谱法（HPLC）

与GC 法相比，HPLC 法不需要衍生，因此分析速度较快，且可避免交叉污染，但局限性在于灵敏度和检测器的类型，灵敏度明显低于GC 法。常用的检测器有MS、MS/MS、ICP-MS，荧光法目前报道较少。当采用HPLC-MS、HPLC-MS/MS、HPLC-MS/MS 测定丁基锡和苯基锡时，仪器检出限分别为12～700 pg[53]、10 pg[24]、3.0 pg[50]。HPLC 法需要选择合适的流动相和固定相，后者包括离子交换、反相、正相、离子对、空间排阻、胶束等[51]。固定相可以通过离子交换或反相色谱法进行广泛的分类。离子交换固定相通常以苯乙烯二乙烯基苯树脂或二氧化硅为基础，阳离子有机锡与流动相反离子在固定相上竞争离子位置[51，54]。苯乙烯二乙烯苯树脂膨胀会引起压缩效应，交联克服了这一问题，但会导致传质过程的减少。硅基相比更稳定，允许进行更快的洗脱和使用高压柱。但硅胶柱对pH 敏感，在pH 2～8 时比较稳定，因此，需要使用缓冲溶液来减少峰拖尾[51，54]。在离子交换色谱法中，单取代有机锡的强保留性是个问题，常常需要使用络合剂和pH 梯度洗脱[51]。如对于硅胶柱，流动相使用甲醇（v/v，50%～90%）和添加盐（如0.005～0.2 mol·L-1的醋酸铵或柠檬酸盐）[51，54]。而在反相色谱法中，流动相通常是带有有机溶剂的水，因而洗脱强度随时间的增加而增加[51，55]。

3 小结

OTs 的分析检测方法已经取得了较大的进展，现有的检测技术基本能满足大部分环境样品分析要求。在实际样品分析时，应根据样品性质选择合适的前处理方法和检测方法。对于OTs 的超痕量分析目前仍具有一定的挑战，需要专门的实验室和仪器设备方面的高成本投入。虽然GC 法灵敏度高于HPLC，但前处理仍然相当复杂和耗时，提取和衍生过程是分析误差的主要来源。在自动化、小型化和减少劳动力方面，在线SPME 和LPME 作为样品提取和预富集手段取得了较大的进展，但目前仍未被推广普及。使用硅橡胶被动采样器进行长期原位监测，并结合高灵敏的分析方法，为实现许多国际指令所要求的低浓度有机锡检测提供一条前进的道路。