花生白绢病生防菌筛选及防控作用研究

张金凤，成 波，曹延丽，迟玉成，鄢洪海*

(1.青岛农业大学植物医学学院，山东 青岛 266109；2.山东省花生研究所，山东 青岛 266100)

花生是世界上最重要的油料作物，在我国栽培历史悠久，种植面积居世界第二位，产量居世界第一位，是我国为数不多的具有出口优势的农作物之一[1]。花生白绢病是花生的一种重要土传真菌病害，世界各地均有发生，在美国和印度危害尤为严重[2]。近年来，由于耕作制度的改变，花生种植密度的增加，使得田间小气候显著改变，导致花生白绢病在我国一些主要种植区发生逐年加重，成为北方生产田的重要病害[3]。花生白绢病是由齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)侵染引起的土传真菌病害，该病原菌具有寄主范围广，能侵染500多种植物，其中包括小麦、大豆、花生等一些重要农作物[4]。

生产上防控花生白绢病以化学防治为主，因此存在着许多问题，如农药残留、污染环境、对人畜健康伤害大等。相比之下，生物防治有着安全、环保等优点。在众多的生防菌中，木霉(Trichodermaspp.)以其高效性和广谱性应用最为广泛，对病原真菌如镰刀菌(Fusariumspp.)、腐霉(Pythiumspp.)、疫霉(Phytophthoraspp.)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)均有抑制作用[5]。木霉菌可防控多种病原真菌，对土传病害的防控尤为显著，利用木霉菌可防治黄瓜枯萎病[5]、马铃薯黄萎病[6]、烟草黑胫病[7]及苦瓜枯萎病等[8-11]。

芽孢杆菌不仅能够抑制植物病原真菌的生长繁殖，而且可以诱发植物抗病力增强[12]，如用芽孢杆菌防治花生白绢病[13]、烟草黑胫病[14]、烟草白粉病[15]等，Yongli对芽孢杆菌的研究也证明其具有诱导抗病性作用[16-17]。

本试验研究了木霉菌和芽孢杆菌对花生白绢病的防治效果及对花生植株抗性生理的影响，意在为今后木霉菌和芽孢杆菌制剂的研发及应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。供试菌株：木霉菌筛选采用土壤分离法获得。取花生田植株根际的土壤1g，用无菌水稀释制备10-1、10-2和10-3的土壤悬浮液。将10-2、10-3稀释液1mL倒入灭菌的培养皿中，待PDA冷却倒入培养皿，使土壤悬浮液与PDA充分混匀。于26℃的恒温培养箱中暗培养2～3d。获得的菌株进行纯培养、镜检，观察菌丝和孢子梗以及菌落形态特征并初步鉴定其分类地位。芽孢杆菌筛选采用土壤分离法获得。首先制备10-2和10-3的土壤悬浮液，然后采用平板划线法，获得单菌落后再进行纯化培养。花生白绢病菌：从山东省花生研究所莱西试验田发病的花生植株上采集病菌，分离获得。供试花生品种为鲁花11号，由山东省花生研究所提供。

1.2 防治花生白绢病的生防菌株筛选

用打孔器在已经纯化好的木霉菌、芽孢杆菌和白绢病菌培养基上分别制取直径为1cm的菌饼，将白绢病菌菌饼置于PDA培养皿中距离中心点2cm的一侧，而距离2cm的另一侧分别放置木霉菌或芽孢杆菌菌饼，以无菌空白PDA饼块作为对照，每个处理重复3次。对峙培养在26℃恒温培养箱中进行，2～3d后观察木霉菌、芽孢杆菌对白绢病菌拮抗和抑制效果，7d后测定抑菌效果。

抑菌率/%=(对照菌落直径-处理菌落直经)/对照菌落直经×100

(用十字交叉法测量病菌菌落直径)

1.3 生防菌对花生白绢病控制作用

1.3.1 盆栽防控效果试验

将灭菌后的土壤装在塑料盆中，把提前催芽的花生种子播于盆中，每盆10粒，共4个处理1个对照，重复3次。花生出苗后每盆只保留8株，之后正常管理，于开花期接种花生白绢病菌，即直接把病原真菌接种到土壤中，并于2d后将筛选出来的木霉菌株和芽孢杆菌同样接种到土壤中，进行防治花生白绢病效果测定。

1.3.2 菌株防控白绢病效果检测

采取病情指数法进行防治效果测定，花生白绢病分级标准见表1。

病情指数=∑(各级病根数×各级代表值)/(调查总根数×最高级代表值)×100

防治效果/%=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

1.3.3 花生防御酶活性测定

在花生接菌前和花生发病时分别对花生叶片进行取样，用于寄主防御酶活性测定。叶片SOD、CAT防御酶活性的测定参照刘家尧等[18]方法。

1.4 生防菌木霉菌与芽孢杆菌分子鉴定

1.4.1 芽孢杆菌RNA提取

菌种在液体培养基中过夜，取1.5mL菌液于EP管中，8000r/min离心1min获得菌体，参考Frederick等[19]从细菌中制备基因组RNA法提取芽孢杆菌RNA。扩增引物为27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。50μL PCR反应体系：在PCR反应管中加入10μL Taq PCR master Mix、2μL PrimerF、2μL PrimerR、1μL DNAtemplate，双蒸水补足至50μL。根据下列参数进行PCR扩增：预变性94℃ 4min、变性 94℃ 30s、退火 55℃ 30s、延伸 72℃ 1min，35个循环，最后延伸 73℃10min。

表1 花生白绢病病情分级标准

取5mL PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳后用手提式紫外灯分析仪观察条带，并送往生工生物工程股份有限公司进行测序。27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。50μL PCR反应体系：在PCR反应管中加入10μL Taq PCR master Mix、2μL PrimerF、2μL PrimerR、1μL DNAtemplate，双蒸水补足至50μL。根据下列参数进行PCR扩增：预变性94℃ 4min、变性 94℃ 30s、退火 55℃ 30s、延伸 72℃ 1min，35个循环，最后延伸 73℃10min。

取5mL PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳后用手提式紫外灯分析仪观察条带，并送往生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.4.2 木霉菌DNA提取

将获得的木霉菌株接种到PDA培养基中，培养2～3d。取适量菌丝于研钵中，加液氮研磨成粉末，移入EP管中。参照Frederick[21]利用CTAB法制备植物DNA法提取木霉菌DNA。扩增引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。20μL PCR反应体系：在PCR反应管中加入10μL 2xMix、1μL Primer 2 、2μL DNA凝胶、双蒸水补足到20μL。根据下列参数进行PCR扩增：预变性94℃ 2min、变性 94℃ 30s、退火 55℃ 30s、延伸 72℃ 1min、35个循环、最后延伸 72℃ 10min[21]。取5mL PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳后用手提式紫外灯分析仪观察条带，并送往生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.5 数据统计与分析

利用Microsoft Excel 2016对结果进行图表制作和对数据进行分析，利用NCBI进行序列DNA鉴定，利用MEGA.7构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 分离的供试生防菌菌株室内抑菌测定

从土壤中获得的真菌经镜检(图1)确定8个为木霉菌株，从土壤中获得的1株细菌经革兰氏染色及性状观察确定为芽孢杆菌。经平板对峙抑菌试验筛选有3个木霉菌株抑菌效果较好(图2)，对花生白绢病菌的抑制率分别为：T1菌株58.52%、T2菌株47.73%、T3菌株39.02% ；1株芽孢杆菌对白绢病菌的抑制率60.8%(表2)，其抑菌效果最好(图4)。

图1木霉菌形态

Fig.1Trichodermamicroscopy

图2木霉对花生白绢病菌的抑制效果

Fig.2AntagonisticeffectsofTrichodermaonCorticiumrolfsiiSaccardo

图3花生白绢病菌(CK)

Fig.3CorticiumrolfsiiSaccardo(CK)

图4芽孢杆菌对花生白绢病菌抑制效果

Fig.4AntagonisticeffectofBacillusonCorticiumrolfsiiSaccardo

表2 木霉及芽孢杆菌对白绢病菌的抑制率

表3 生防菌株的相似性分析与分子鉴定

2.2 木霉菌及芽孢杆菌菌株鉴定

对筛选出3株防治效果较好的木霉菌菌株和1株细菌菌株进行形态观察和性状观测，发现属的特征较显著，但种的特点不明确，为此，对它们进行基因测序和分子鉴定(表3)。将测序获得的木霉菌株序列在NCBI上以ITS序列进行BLAST，进行同源性分析。结果T1与棘孢木霉的基因相似度99.83%，T2与拟康宁木霉的基因相似度100%，T3与钩状木霉的基因相似度99.83%。测序获得的芽孢杆菌序列在NCBI上以16s rDNA序列采用BLAST进行同源性分析，T4与蜡状芽孢杆菌的基因相似度为99.66%。

通过对木霉菌株ITS序列的测定，与NCBI上相似序列进行比对，选择同源性较高的3个菌株。利用MEGA.7软件，将木霉的ITS序列作为外接菌，使用最大似然法构建病原真菌系统发育树，如图5。采用Bootstrap1000次检验进化树各分支的置信度。结果表明，木霉菌株T1聚类到Trichodermaasperllum进化分枝上，木霉菌株T2聚类到T.asperellum进化分枝上，木霉菌株T3聚类到T.hamatum进化分枝上。T2与拟康宁木霉有较大的亲缘关系；T1与棘孢木霉有进化关系；T3与钩状木霉有较大的亲缘关系。分子生物学鉴定和形态学鉴定一致，T1菌株为棘孢木霉T.asperellum，T2菌株为拟康宁木霉T.koningiopsis，T3菌株为钩状木霉T.hamatum。通过对芽孢杆菌16s rDNA序列的测定，与NCBI上相似序列进行比对，选择同源性较高的3个菌株。利用MEGA.7软件，将欧文氏菌的16s rDNA序列作为外接菌，使用最大似然法构建病原细菌系统发育树，如图6。采用Bootstrap 1000次检验进化树各分支的置信度。结果表明，芽孢杆菌菌株T4聚类到Bacilluscereus进化分枝上，因此T4菌株为蜡状芽孢杆菌Bacilluscereus。

图5 木霉菌株进化树

图6 芽孢杆菌进化树

2.3 生防菌株防控花生白绢病效果测定

土壤接种不同拮抗木霉和芽孢杆菌后，各个菌株对花生白绢病均有一定的防治效果(表4)。棘孢木霉的防治效果最好，防治效果可达68.05%，但是发病率为42.86%。拟康宁木霉的发病率最低为38.10%，防治效果为65.77%。钩状木霉的发病率为40%，防治效果为56.87%，防治效果较差。芽孢杆菌的发病率在4组处理中最高为61.7%，防治效果仅为13.28%。

2.4 供试生防菌株处理对花生植株抗性的影响

2.4.1 花生叶片中超氧化物歧化酶(SOD)变化

图7表明，接种不同菌种花生叶片中超氧化物歧化酶在发病前与发病后变化差异较大。花生白绢病发病后超氧化物歧化酶的活性显著高于发病前，其中以接种棘孢木霉的花生叶片超氧化物歧化酶最高，芽孢杆菌次之。

图7接种花生白绢病菌对花生植株SOD活性的影响

Fig.7EffectofinoculationofCorticiumrolfsiiSaccardoonSODactivityofpeanutplants

注：T1为棘孢木霉，T2为拟康宁木霉，T3为钩状木霉，T4为蜡状芽孢杆菌。下同。

图8接种花生白绢病菌对花生植株中CAT活性的影响

Fig.8EffectofinoculationofCorticiumrolfsiiSaccardoonCATactivityinpeanutplant

Note:T1isT.asperellum,T2isT.koningiopsis,T3isT.hamatum,T4isBacilluscereus.Thesameasbelow.

2.4.2 花生叶片中过氧化氢酶(CAT)的变化

图8表明，接种不同菌种花生叶片中过氧化氢酶在发病前与发病后变化差异大。花生白绢病发病后过氧化氢酶的活性显著高于发病前，其中以接种芽孢杆菌的花生叶片过氧化氢酶最高，钩状木霉次之 (图8)。

3 结论与讨论

3.1 本试验从种植花生的土壤中分离到多株木霉菌和芽孢杆菌，但通过对峙培养筛选仅获得3株木霉菌和1株芽孢杆菌对花生白绢病菌抑制效果较好。经菌株形态观察和DNA基因序列扩增比对，3个木霉菌株分别为棘孢木霉、拟康宁木霉和钩状木霉，芽孢杆菌为蜡状芽孢杆菌。

3.2 经培养皿对峙培养试验，对花生白绢病菌抑制效果依次为芽孢杆菌>棘孢木霉>拟康宁木霉>钩状木霉；盆栽接菌处理防病试验效果依次是拟康宁木霉>钩状木霉>棘孢木霉>芽孢杆菌，生防菌对白绢病菌的拮抗作用与盆栽试验具有一定相关性，但并不完全呈正相关。张春秋等人研究的木霉与黄瓜枯萎病的平板对峙试验和盆栽试验[5]结果也证明了这一点。这可能是由于生防菌的生长速度快，在平板试验中由于环境适宜、养分充足等原因在竞争中占明显的优势，但是在盆栽试验中，可能由于土壤湿度、温度、物理化学等诸多因素，对结果产生一定的影响，没有表现出明显的优势。

3.3 当植物用生防菌或诱抗剂处理时，植物体内的SOD酶、CAT酶等防御酶活性往往会升高[5，8]。本试验在接种白绢病菌的花生土壤中施入生防木霉和芽孢杆菌后测定SOD等主要的防御酶系，发现花生植株体内SOD酶、CAT酶也发生了不同程度升高，说明木霉菌和芽孢杆菌诱导了花生植株对白绢病菌的抗病性，这可能与防病控病作用有关。