高效液相色谱-串联质谱法测定酒类产品中13种甜味剂

王丽娟，柯润辉，石 磊，安红梅，杨春艳，陈嘉杰，吴奕萱

（1.青岛大学环境科学与工程学院，山东青岛 266071；2.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100015）

甜味剂是一类重要的食品添加剂，能改善食品风味和口感，提高食品品质，尤其是人工甜味剂因成本低、甜度高、大多不参与代谢过程等优点成为蔗糖的代用品广泛应用于现代食品工业[1-3]，但其可能存在的食品安全风险也一直备受争议。因此，甜味剂的安全性和使用限量一直是各国政府和相关机构关注的热点。我国《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定了甜味剂的使用范围和限量[4]。随着食品工业的发展，复合甜味剂的使用和新型甜味剂的开发成为发展的潮流和趋势，但这也对监管提出了新的挑战。2008年11月，美国食品药品管理局（FDA）批准瑞鲍迪苷A可以作为甜味剂应用到美国的食品和饮料中[5]。2014年5月，美国FDA批准高倍甜味剂爱德万甜作为非营养甜味剂和增味剂用于除肉类及家禽之外的食品中[6]。随后，欧盟和我国也相继批准使用食品添加剂新品种爱德万甜。考虑到人工甜味剂的使用所带来的安全隐患，近年来“植物甜味剂”的产量和使用量持续增长。目前，国际市场上产业化和销路最好的天然植物甜味剂为甘草甜素、甜菊糖（甜叶菊甙）和罗汉果甙[7]，并应用于食品工业，但鲜有此类甜味剂相关检测方法的报道。酒类作为一个重要的日常消费品，其质量安全决定了消费安全。近年来，我国酿酒行业发展势头良好，生产技术水平和产品质量不断提升，但也存在较多问题。由于经济利益驱使，一些不法商贩为掩盖酒体苦、涩等不良口感，改善风味，出现在酒中违法添加非自生发酵产物的现象。根据国家食品安全监督抽检结果，酒类产品中违法或过量添加甜味剂是其中一个突出问题，已成为监管重点，但仍有一些企业通过变换种类等方式逃避监管，将未纳入监管范围的一些新型甜味剂（包括植物甜味剂）作为替代品，谋取不正当利益。因此，建立快速、准确测定酒类产品中包含人工新型甜味剂和天然甜味剂在内的复合甜味剂的方法显得非常必要。

近年来，国内外关于酒类产品中甜味剂的研究很多[8-10]，我国也建立了关于甜蜜素、糖精钠、阿斯巴甜等传统甜味剂检测的国家标准[11-13]，但这些研究与标准多针对一种或几种甜味剂，且大多为液相色谱法[14-16]，抗干扰能力较弱，易产生假阳性的情况，即使近几年发布的行业标准[17]和相关文献[1，18-19]，检测种类也并不广泛，对于批准使用的甜味剂新品种，鲜有文献报道，仅可查到的几篇也没有针对酒类产品的检测[6，20]，更没有相关的检测方法标准、产品使用限量指标等。本研究利用高效液相色谱-串联质谱技术建立了酒类产品中13种人工及天然甜味剂的检测方法，覆盖了目前市场上商品化使用的人工甜味剂种类。本方法简便、快速、灵敏，为酒类产品的生产和流通领域中甜味剂的监测提供了技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：白酒、葡萄酒、黄酒样品，购自零售超市和商店。

仪器设备：LCMS-8050高效液相色谱-串联质谱仪（日本Shimadzu公司，具体配置为LC-20ADXR×2输液泵，SIL-20AXR自动进样器，DGU-20A3R在线脱气机，CTO-20AC柱温箱，CBM-20A系统控制器，LCMS-8050三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver.5.91色谱工作站）；超声波清洗器（KQ-500DE，昆山超声仪器有限公司）；Milli-Q Reference超纯水器（美国Millipore公司）；Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm,1.8 µm，美国Waters公司）；0.22 μm尼龙滤膜（上海安谱科学仪器有限公司）。

试剂：乙腈、甲醇、乙酸、乙酸铵（HPLC级，Dikma公司）；甜蜜素（Sodium cycamate）、糖精钠（Saccharin sodium）、安赛蜜（Acesulfame-K）、阿斯巴甜（Aspartame）、三氯蔗糖（Sucralose）、甜菊糖苷（Stevioside）、纽甜（Neotame）、阿力甜（Alitame）、甘草酸（Glycyrrhizic acid）、爱德万甜（Advantame）、瑞鲍迪苷A（Rebaudioside A）、罗汉果苷V（Mogroside V）、18β-甘草酸（18β-Glycyrrhetinic acid），美国Sigma-Aldrich公司，加拿大TRC公司和德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，纯度≥95%。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取13种人工及天然甜味剂标准品于10 mL棕色容量瓶中，用水或甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为1 mg/mL的单标储备液，于-18 ℃避光保存。用甲醇稀释并配制中间浓度的标准工作液，于4 ℃避光保存。根据需要用流动相逐级稀释，配制成适当浓度的混合标准工作液，现配现用。

1.3 样品前处理方法

取葡萄酒、黄酒样品2.0 mL于10 mL容量瓶中，用超纯水定容，超声混匀，过0.22 μm滤膜，滤液供测定。

准确吸取10 mL白酒样品于50 mL烧杯中，于60 ℃恒温水浴锅加热蒸发至体积不再减少，停止加热，冷却至室温后转移至50 mL容量瓶中，用超纯水多次淌洗烧杯合并溶液至容量瓶，定容，过0.22 μm滤膜，滤液供测定。

1.4 检测条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm,1.8µm，美国Waters公司）。流动相：（A）甲醇和（B）10 mmol/L乙酸铵水溶液，流速0.35 mL/min；梯度洗脱程序为：0 min，甲醇的体积分数为10%；0～1 min，甲醇的体积分数从10 % 升至50 %，1～3 min，甲醇的体积分数从50%升至80%，3～4 min，甲醇的体积分数从80%升至100%，并保持1.5 min；5.51 min，甲醇的体积分数从100 %降至10 %；5.51～6.5 min，甲醇的体积分数保持10%。柱温为35 ℃；进样体积：2 μL。

1.4.2 质谱条件

分析仪器：LCMS-8050；离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子模式扫描；离子源接口电压：0.5 kV；雾化气：氮气3.0 L/min；干燥气：氮气10 L/min；碰撞气：氩气；DL温度：250 ℃；加热模块温度：400 ℃；扫描模式：多反应监测(MRM)；驻留时间：15 ms；延迟时间：3 ms；13种人工及天然甜味剂标准品MRM参数：见表1。

2 结果与讨论

2.1 甜味剂种类的选择

表1 13种甜味剂的保留时间和质谱条件

本研究选择了13种人工及天然甜味剂，主要包括酒类产品检测标准中规定检测的甜味剂（甜蜜素、糖精钠、安赛蜜等），文献报道和市场调研酒类产品中可能使用的甜味剂（纽甜、甜蜜素），对于上述常见人工甜味剂我国建立了标准检测方法，且进行了严格的监管[21]，本研究也包含了鲜有文献报道检测方法的新型甜味剂（爱德万甜）及天然甜味剂（甘草酸、18β-甘草酸、罗汉果苷V、瑞鲍甜苷A、甜菊糖苷），覆盖了市场上较为容易获得的甜味剂种类。

2.2 色谱和质谱条件的优化

2.2.1 流动相的选择

流动相是影响峰形、响应值、分离度、柱压和分析时间的重要因素[22]。反相色谱的流动相通常由有机溶剂（如甲醇、乙腈）和水组成，本研究对流动相进行了考察和优化，结果表明，有机相为强洗脱溶剂乙腈时，组分分离较差，且乙腈比甲醇毒性更大，因此选择甲醇为分析的有机相。水相常用缓冲盐溶液和弱酸性溶液，以增加电离度，提升响应值，实验比较了甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸铵溶液、甲醇-乙酸水溶液3种流动相体系，发现甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸水溶液为流动相时，部分甜味剂色谱峰较宽且拖尾严重，故选择甲醇-乙酸铵溶液为流动相，进一步对乙酸铵的浓度进行优化，比较了5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L 3个不同浓度的乙酸铵水溶液的分离效果，发现5 mmol/L乙酸铵水溶液为水相时，响应值较10 mmol/L低，继续加大其浓度，响应值增加并不明显，且较高浓度的非挥发缓冲盐溶液进入质谱，对离子源会造成一定程度的污染。10 mmol/L乙酸铵水溶液为水相时，因瑞鲍迪苷A的一个子离子与甜菊糖苷母离子相同，未达到基线分离，但通过质谱通道，可以完成定量分析，其他11种甜味剂均可达到基线分离，故得到最优的流动相组成为甲醇-10 mmol/L乙酸铵溶液。

2.2.2 质谱条件的选择

对13种甜味剂分别在全扫描模式（MRM）下进行扫描，分别确定其准分子离子。根据13种人工及天然甜味剂的分子结构特征，大部分甜味剂在电喷雾离子源中易失去H+成为R-COO-和R-SO3-，且在负离子监测模式下准分子离子峰强度高于正离子模式，本研究比较了正离子和负离子模式下各物质的响应值，发现大部分目标化合物在负离子模式下的响应值明显优于正离子模式，爱德万甜则在正负离子模式下均有很高的响应，为降低正负离子同时检测的干扰，均选择电喷雾离子源负离子模式对其进行检测。利用仪器的自动优化功能，分别对Q1、Q3、CE等进行优化，确定13种人工及天然甜味剂的母离子和子离子的最佳质谱条件，各化合物的质谱条件见表1。13种人工及天然甜味剂的总离子流图见图1。

图1 13种甜味剂混合标准溶液的总离子流图

2.3 样品前处理条件的优化

由于白酒中含有高浓度的乙醇及微量香味成分，使用质谱检测器检测时，乙醇会影响待测物的测定。葡萄酒、黄酒中虽然乙醇含量浓度比例较低，但因其含有一定比例的糖类及色素，在质谱测定时，也会造成基质抑制效应。为减少基质效应的影响，本研究对酒精度较高的白酒进行加热除乙醇，针对葡萄酒、黄酒则进行稀释后进样，以降低基质效应的影响。

2.4 方法学评价

2.4.1 方法的线性范围和检出限

将13种人工及天然甜味剂的标准储备液用流动相分别配制系列混合标准工作液，按上文1.4部分所确定的色谱和质谱条件进行检测，以各组分定量离子色谱峰面积对相应的质量浓度绘制各被测物的标准工作曲线，结果表明，13种人工及天然甜味剂在一定浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）均大于0.995。以信噪比为3确定方法的检出限（LOD），以信噪比为10确定方法的定量限（LOQ）。结果见表2。

表2 13种甜味剂的线性范围、线性方程、相关系数和检出限

表3 酒类产品13种甜味剂添加回收率和相对标准偏差(n=6)

2.4.2 精密度和回收率

分别选取空白白酒、黄酒、葡萄酒做回收率实验，用微量移液器向空白酒中准确加入一定量的13种人工及天然甜味剂标准溶液，配成低、中、高3个浓度水平进行回收率实验，按1.3节所述实验步骤进行处理和测定，进行6次重复实验，计算其回收率及相对标准偏差（RSD）。结果表明，各目标物平均回收率在90.6 %～106.5 %之间，相对标准偏差小于8.8%（表3），方法的准确度和精密度均符合多残留分析的要求。

2.5 实际样品的测定

按所建立的方法对购自零售超市和商店的共10批次葡萄酒、5批次白酒和5批次黄酒样品进行了13种人工及天然甜味剂的筛查，每个样品重复测定3次。所检葡萄酒样品中有1个检出安赛蜜、糖精钠和甜蜜素，含量分别为28.93 μg/L、3399.67 μg/L、566.45 μg/L，其余样品的检测结果均为阴性。葡萄酒阳性样品的MRM质谱图见图2。

图2 某葡萄酒样品中检出的安赛蜜、糖精钠和甜蜜素质谱图

3 结论

本研究建立了高效液相色谱-串联质谱仪同时测定酒类产品中13种人工及天然甜味剂含量的方法，该方法前处理简单、分析速度快、灵敏度高。对实际样品的检测表明，该方法能够满足酒类产品中13种人工及天然甜味剂的分析要求，与国标方法相比，大大提高了分析效率，降低了分析成本。适合大批量酒类产品中13种人工及天然甜味剂的定性和定量分析。