秦岭绿茶茶多酚抑菌活性及其机理研究

陈 琛，徐尤美，蔺蓓蓓，景 娴，刘 祥，付 静，江 海，郑红星

（陕西理工大学中德天然产物研究所/陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中 723000）

茶多酚是从茶叶中提取的一类多酚混合物，是茶叶中的主要品质成分，最高占茶叶干重的30%[1]。茶多酚中的儿茶素类含量约占茶多酚总量的60%～80%，主要包括表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechingallate，EGCG），表儿茶素没食子酸酯（epicatechingallate，ECG），表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC），表儿茶素（epicatechin，EC），儿茶素（catechin，C）等[2]。茶多酚具有多种生物活性和功能，如抗氧化[3]、抗癌[4-5]、抗菌抗炎[6]、预防糖尿病[7]、阿尔茨海默病[8]、肝纤维化[9]、肥胖[10]等。茶多酚具有抗氧化、抗菌、抗辐射等多种生物功能及保健功效，在医药、食品保鲜防腐、动物饲料添加剂等方面展示了广阔的应用前景。茶多酚的提取方法包括[11]：热水提取法、有机溶剂提取法、超临界提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、化学试剂提取法，其中热水提取法比较常用。目前国内外对于茶多酚的研究主要是茶多酚的药理作用、食品保鲜等，在茶多酚的抑菌方面主要开展了对植物病源真菌、稻瘟病菌等的抑菌活性研究，对临床致病病原菌的抑菌作用研究较少。

秦岭绿茶常以清明前后的嫩芽制成“清明茶”出售，而夏秋粗老茶的综合开发利用滞后，造成大量的夏秋粗老茶叶的浪费。本研究主要开展了秦岭绿茶茶多酚的提取工艺、儿茶素分析检测及提取物对标准菌株、临床致病菌的抑菌活性研究，并探索了其抑菌机理，为秦岭绿茶，特别是夏秋粗老茶的综合开发利用及临床应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料

绿茶来自西乡县，茶叶品种为西乡大脚板，采集时间为5 月上旬，鲜叶采摘一芽三叶。

1.1.2 供试菌株

标准菌株：金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC 25923、枯草芽孢杆菌BacillussubtilisATCC 6633、大肠杆菌EscherichiacoliATCC 25922、大肠杆菌EscherichiacoliATCC 8739、伤寒沙门氏菌BacteriumtyphosumATCC 14028、白色念珠菌Candida albicansATCC 10231。

临床分离株：枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus、诺卡氏菌Nocardiaceae、粪肠球菌Enterococcusfaecalis、大肠杆菌Escherichia coli08040726、肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae08031012、嗜麦芽假单胞菌Stenotrophomonas maltophilia、铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa、白色念珠菌Candidaalbicans08022710、白色念珠菌CandidaalbicansIS、光滑念珠菌Candidaglabrata08A802，以上菌株由大连理工大学于海宁教授提供。

1.1.3 主要试剂

儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）5 种标准品（上海同田生物科技公司）；乙腈、甲酸（Fisher Scientific 公司）；LX-17 树脂（西安蓝晓科技新材料股份有限公司）；考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（普利莱基因技术有限公司）；碱性磷酸酶试剂盒（北京雷根生物技术有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 仪器

Waters Acquity-UPLC（美国Waters 公司）；数控超声波提取仪（昆山市超声仪器有限公司）；微波提取仪（南京杰全微波设备有限公司）；旋转蒸发仪RV10 基本型（德国IKA 公司）；722G 可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）。

1.2.2 茶多酚的提取纯化

茶多酚的提取分为3种方法，水浴提取参考A.Bharadwaz 等[12]的方法。超声辅助提取参考朱德文等[13]的方法，略有改动。微波辅助提取参考Li D.C.等[14]的方法，略有改动。以上3种方法提取的茶多酚粗提液分别进一步用大孔吸附树脂LX-17 纯化。茶多酚含量测定采用标准“GB/T 31740.2—2015，茶制品第2 部分”进行[15]，测定茶多酚含量，并计算其得率，按下式计算：

1.2.3 茶多酚中儿茶素的含量的测定

利用本实验室前期建立的UPLC 法[16]测定茶多酚中儿茶素含量。

1.2.4 茶多酚抑菌活性的研究

①抑菌活性测定样品制备。精确称取400 mg 茶多酚溶于10 mL 蒸馏水中，振荡摇匀；取1 mL 对倍稀释，配置成20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL 等浓度，用0.22 μm 滤膜过滤，备用。

②薄层琼脂糖孔穴扩散法。采用薄层琼脂糖孔穴扩散法[17-18]，有抑菌圈的进一步采用肉汤稀释法定量测定最小抑菌浓度。

③常量肉汤稀释法。MIC 的测定采用常量肉汤稀释法并加以改进[19-20]。

1.2.5 茶多酚抑菌机理的研究

①茶多酚对细菌细胞膜通透性的影响。向培养到对数期的B.subtilisATCC 6633 菌液中加入茶多酚，使培养液中茶多酚终浓度为0.1 mg/mL，培养8 h，每隔2 h 取菌悬液5 mL，离心后测电导率，对照以无菌水替代茶多酚[21]。

②培养液中蛋白质含量测定。取培养对数期的B.subtilisATCC 6633 菌液，加入茶多酚使其最终浓度为0.3%，每隔1 h 取样，然后采用考马斯亮蓝法试剂盒测定细菌培养液中蛋白质含量，对照用蒸馏水代替茶多酚。

③培养液中碱性磷酸酶活性测定。将3 倍最低抑菌浓度的茶多酚溶液与B.subtilisATCC 6633 菌液等体积混合，37 ℃摇床培养8 h，每隔1 h 取样，离心取上清液，用碱性磷酸酶试剂盒测定。对照组以蒸馏水代替茶多酚。

1.3 数据统计分析

每个试验做3 次重复，数据采用Excel、SPSS 软件进行分析处理作图。

2 结果与分析

2.1 秦岭绿茶茶多酚提取纯化及检测

采用水浴提取、超声辅助提取、微波辅助提取秦岭绿茶茶多酚，分别进一步用大孔吸附树脂LX-17 纯化，测定茶多酚的含量，计算提取率，3种方法提纯的茶多酚得率见表1。

表1 不同提取方法的茶多酚得率Table 1 The yield of different extraction method on green tea polyphenols

通过上表可以看出，秦岭绿茶通过不同的提取方法，茶多酚得率有较大的差异，得率大小顺序为微波辅助法＞超声辅助法＞水浴提取法。

3种不同方法提纯的秦岭绿茶茶多酚中5 种儿茶素的含量是通过超高效液相色谱法测定，测定结果见表2。秦岭绿茶中5 种儿茶素组分由高到低依次是：表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）＞儿茶素（C）＞表儿茶素没食子酸酯（ECG）＞表儿茶素（EC）＞表没食子儿茶素（EGC）。超声辅助法得到的儿茶素的含量最高，为（579.2±2.4）mg/g，微波辅助提取法得到的儿茶素的含量为（568.1±2.3）mg/g。

2.2 抑菌活性

2.2.1 薄层琼脂糖孔穴扩散法

薄层平板琼脂糖孔穴扩散法测定了茶多酚的抑菌圈大小见表3。从表3 中可以看出秦岭绿茶茶多酚具有广谱抑菌活性，对革兰氏阴性菌（G-）大肠埃希菌、伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜麦芽假单胞菌、绿脓杆菌和革兰氏阳性菌（G+）金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、诺卡氏菌、粪肠球菌、真菌白色念珠菌和光滑念珠菌均有明显抑菌作用。对G+菌B.subtilisATCC 6633 的抑菌圈最大，为（18.4±0.36）mm。

表2 秦岭绿茶儿茶素含量测定Table 2 Content of the individual components in polyphenols

图1 UPLC 分析微波提取法提纯的秦岭绿茶儿茶素含量Figure 1 The chromatogram of tea polyphenols components of UPLC for micro-assisted extraction method

2.2.2 最小抑菌浓度

以常量肉汤稀释法测定了微波提取法提纯的秦岭绿茶茶多酚对16 株菌的最小抑菌浓度，结果如表4 所示。从表中可以看出，MIC 范围是0.0625～2 mg/mL，抑菌效果最好的是B.subtilisATCC 6633和C.glabrataMIC 为0.0625 mg/mL，对肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果最弱，MIC 为2 mg/mL。

2.3 茶多酚抑菌机理

2.3.1 对细菌细胞膜通透性的影响

细胞外膜是细菌的保护屏障，当细菌遇到抗菌物质时细胞膜会被破坏，细菌的保护屏障被打破，细胞内的K+、Na+等小分子物质就会外泄，进而使细菌培养液的电导率上升，因此细菌培养液电导率的变化能够反映细菌细胞膜通透性的变化。

以抑菌活性最好的B.subtilisATCC 6633 为作用菌株，结果显示（见图2），茶多酚能影响枯草芽孢杆菌的电导率，60 min 内茶多酚处理组和对照组电导率变化不明显，但是当60 min 后，并随着作用时间的延长，茶多酚对细胞膜逐渐产生破坏作用，致使B.subtilisATCC 6633 菌液的电导率逐渐上升，说明茶多酚可改变大枯草芽孢杆菌细胞膜的通透性，使细胞内的物质发生外漏。

表3 茶多酚的抑菌活性Table 3 Antimicrobial activity of green tea polyphenols

表4 茶多酚最小抑菌浓度Table 4 Minimum inhibitory concentration (MIC) of green tea polyphenols

2.3.2 细菌培养液中蛋白浓度的测定

正常情况下细菌细胞壁的微孔仅容许小于1 nm的分子通过，大分子蛋白不能透过细胞壁，当细胞壁通透性发生改变，一些大分子蛋白质也能透过细胞壁分泌到胞外[22]。培养液中蛋白质含量测定结果（见图3）表明秦岭绿茶茶多酚对B.subtilisATCC 6633 细胞膜渗漏具有显著的影响，添加茶多酚后6 h的枯草芽孢杆菌培养液中蛋白浓度为310 μg/mL，而未加茶多酚处理的对照组，其培养液中蛋白浓度非常低，仅为34 μg/mL，添加秦岭绿茶茶多酚的培养液组蛋白浓度远高于对照组，茶多酚组与对照组相比差异显著（P＜0.05）。

2.3.3 培养液中碱性磷酸酶活性测定

通常情况下在胞外检测不到碱性磷酸酶的活性，一旦细胞壁或细胞膜遭到破坏后，菌体细胞的细胞壁通透性增加，碱性磷酸酶会释放到细胞外，通过测定细胞外碱性磷酸酶活性的变化便可反映细胞壁的透性变化。试验结果（见图4）表明当作用6 h 时，测定了茶多酚组和对照组培养液中碱性磷酸酶活性，茶多酚组与对照组相比差异极显著（P＜0.01）。

图4 茶多酚作用B.subtilis ATCC 6633 细菌培养液中碱性磷酸酶活性Figure 4 Effect of tea polyphenols on extracellular AKP content of B.subtilis ATCC 6633 culture medium

3 讨论与结论

本研究中秦岭绿茶通过不同的提取方法，茶多酚得率有较大的差异，得率顺序大小为微波辅助法＞超声辅助法＞水浴提取法。江慎华等[23]报道采用水浴振荡提取、微波辅助提取、超声辅助提取和超声-微波协同提取丁香总多酚、总黄酮的得率结果与本研究结果一致，得率高低依次为：微波辅助法＞超声辅助法＞水浴振荡法。周勇等[24]研究荷叶活性物质提取的研究中得到微波辅助法要优于超声辅助法的结论。本研究中通过UPLC 测定了3种不同提取方法提取所得茶多酚中儿茶素的含量，超声辅助法得到的儿茶素的含量最高，达到了（579.2±2.4）mg/g，微波辅助提取法得到的儿茶素的含量达到了（568.1±2.3）mg/g。Xi J.等[25]报道通过HPLC 测定了不同提取方法提取的杭州绿茶中5 种儿茶素，其中通过超声提取法儿茶素的含量为（486±5.42）mg/g，微波提取法儿茶素的含量为（398±6.42）mg/g，两种方法提取的儿茶素含量均低于本研究所得的秦岭绿茶中儿茶素的含量。

通常情况下，茶多酚对G+菌的抑制作用比对G-菌的抑制作用强，Y.Yoda 等[26]比较EGCG 对G+菌的葡萄球菌属和G-菌的敏感性的研究结果显示，EGCG 对葡萄球菌的MIC 为0.050～0.1 mg/mL，而对G-菌的MIC≥0.8 mg/mL。A.Araghizadeh 等[27]的研究了绿茶提取物对龋齿和牙周来源的临床分离株的抑菌活性，也发现茶多酚对G+菌的抑制作用明显高于对G-的抑制作用。本研究的结果也与以上两个研究小组的结果相似，秦岭绿茶茶多酚对6 株G+菌的平均MIC=0.198 mg/mL，对7 株G-菌的平均MIC=0.929 mg/mL，说明秦岭绿茶茶多酚对G+菌的抑菌作用优于G-菌。究其主要原因是茶多酚能特异性地凝固细菌蛋白、破坏细菌细胞膜结构，与细菌遗传物质DNA 结合，从而改变细菌生理抑制生长。

茶多酚对真菌具有显著的抑制效果，D.María等[28]研究了发现单体EGCG 对标准菌株C.albicansATCC 10231 和12 株临床分离真菌菌株的抑菌活性，EGCG 对C.albicansATCC 10231 的MIC 为0.004 mg/mL，对临床分离株的MIC 为0.001～0.032 mg/mL，而本研究秦岭绿茶茶多酚对C.albicansATCC 10231的MIC 为0.125 mg/mL，分析原因可能是本研究中所用的茶多酚是粗提物（茶多酚混合物），混合物的抑菌活性没有茶多酚单体的抑菌活性高，纯化的茶多酚单体抑菌活性要高于粗提物的抑菌活性，且茶多酚的4 种主要儿茶素抑菌活性强弱顺序为EGCG＞ECG＞EGC＞EC。M.Hirasawa 等[29]研究了茶多酚对14株抑制白色念珠菌的活性，MIC 范围是0.062 5～0.25 mg/mL，且认为茶多酚抑制白色念珠菌的活性与pH 值有关，在pH 值为7.0 抑制活性最好。

以秦岭绿茶为原材料，采用水浴、超声辅助、微波辅助3种方法提取茶多酚，大孔树脂LX-17 纯化。秦岭绿茶茶多酚对16 株菌株均有抑菌作用。经茶多酚处理后细菌培养液的电导率、蛋白浓度和碱性磷酸酶活性均增大，由此说明了茶多酚可以破坏细胞膜的完整性，导致细胞通透性增加，致使细胞内容物泄露到胞外，初步阐明茶多酚的抑菌机理。