中国部分地区圈养丹顶鹤饲料中真菌毒素污染分析

刘大伟，周用武，费宜玲，谢春平，刘宏毅，鲁长虎，侯森林

（1.南京森林警察学院/野生动植物物证技术国家林业局重点实验室，南京 210023；2.南京林业大学，南京 210037）

真菌毒素主要由曲霉菌属、镰刀菌属以及青霉菌属的真菌产生[1]。农作物在田间即可被真菌污染，在运输、加工以及储存过程中如果环境条件适合，真菌会继续生长，毒素含量也会持续增加，就目前的技术手段尚无法完全避免[2]。真菌毒素能够致癌、致畸和致突变，食用被其污染的食物或饲料将会严重危害人和动物的健康[3-4]。

由饲料受到真菌毒素污染而引发的圈养野生动物发病或死亡病例有很多。曾经在美国发生过300 多只圈养美洲鹤（GrusAmericana）、沙丘鹤（G.canadensis）真菌毒素中毒，其中15 只死亡的事件[5]。2006 年，在我国福州大熊猫研究中心发生了小熊猫霉菌毒素中毒性肝炎的群发病案。经诊断，引起这次发病的原因是动物饲料受到脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）的污染[6]。郑先春等[7]报道了一起成年丹顶鹤肝癌死亡的病例，其死因很有可能是动物长期食用了被黄曲霉毒素污染的饲料。这3 个报道只是真菌毒素对圈养野生动物危害的一个缩影。在实际中肯定还有很多野生动物真菌毒素中毒、死亡而没有被报道的情况发生。加之在临床诊断中兽医常常会忽视真菌毒素在动物疾病发生、发展的作用[8]。因此，圈养野生动物饲料受到真菌毒素污染的问题应该得到足够的重视。

丹顶鹤是全球濒危物种[9]。有学者指出，人工条件下进行饲养繁育并在适当的时候进行野化放归是阻止濒危动物野外灭绝的一种有效的手段[10]。为此，我国很多野生动物园、自然保护区、湿地公园开展了这一珍稀鹤类的人工繁育工作。周大庆等[11]报道，目前中国动物园圈养的丹顶鹤主要分布在东北、华北和华东地区，占全国总数的74.3%。

在我国，圈养条件下丹顶鹤的食物是各饲养机构各自加工的颗粒饲料。这些饲料的主要成分是容易受到真菌感染的农作物及其副产品，如花生、玉米、小麦、豆粕、麸皮、鱼粉等。目前，国内外为了掌握真菌毒素污染规律，控制毒素带来的风险，每年都会对各类型饲料及其原料的污染情况进行调查。然而，圈养野生动物所食用的饲料在加工、生产等相关环节上还没有形成规模化、商品化，对于这些饲料中的真菌毒素发生规律、污染水平都还没有受到过关注。本研究旨在通过对圈养丹顶鹤数量较多的东北、华北、华东地区丹顶鹤饲料样品中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、DON、ZEN、T-2 毒素（T-2 toxin，T-2）和赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）水平的调查，了解丹顶鹤饲料受到真菌毒素污染的现状，为预防和控制真菌毒素污染提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料与仪器

AFB1、DON、ZEN、T-2、OTA 标准毒素（SIGMA公司）；免疫亲和柱（R-Biopharm，德国）；色谱级甲醇、乙腈、乙酸（CNW 公司）；三氟乙酸（国产分析纯）；GF/C 玻璃纤维滤纸、Whatman No.4 滤纸（上海根利商贸有限公司）；针式滤器（0.45 μm，CNW 公司）。

LC-20AT 高效液相色谱仪（日本岛津）、SPD-20A紫外检测器（日本岛津）、RF-10AXL 荧光检测器（日本岛津）、Inertsil ODS-SP 色谱柱（250 mm×4.6 mm）（日本岛津）、Inertsil ODS-SP 色谱柱（150 mm×4.6 mm）（日本岛津）、超纯水机（优普UPT-II-5T，成都超纯科技有限公司）、粉碎机（XL-04A，广州旭朗机械设备公司）、涡旋振荡器（WH-1 上海沪西分析仪器厂）、氮吹仪（OA-SYSTMN-EVAPTMIIIOrganomation Associates, JNC）。

1.2 样品采集

2014 年11 月—2015 年1 月，从东北地区的吉林向海国家级自然保护区和沈阳森林动物园，华北地区的北京动物园、山东黄河三角洲国家级自然保护区和石家庄动物园，华东地区的江苏盐城国家级珍禽自然保护区、南京红山森林动物园和合肥动物园等8 家丹顶鹤饲养机构采集62 份硬颗粒饲料样品（具体采样情况见表1）。这些饲料均为各饲养机构按照国家相关畜禽饲料标准自行配制、生产。样品经干燥后，在水分含量小于14%时进行封装、储存。在封装过程中，按照《饲料采样方法》（GB/T14699.1-2005）[12]要求进行采样。所有样品均要求达到500 g，粉碎过20 目筛后密封保存在-20 ℃冰箱中。

表1 不同区域样品采集表Table 1 Numbers of samples collected in different regions

1.3 毒素检测

按照Liu D.W.等[13]的高效液相色谱条件对样品中AFB1、DON、ZEN、T-2、OTA 含量进行检测，相关参数见表2。

表2 样品中5 种毒素的高效液相色谱参数Table 2 The HPLC parameters for the analysis of 5 mycotoxins in the feeds

1.4 数据分析

数据用Excel 2007 统计检出率，使用SPSS 16.0统计软件进行分析，各地区间不同毒素水平差异采用One-way ANOVA 进行分析，用LSD 法进行多重比较。在方差分析前对数据进行方差齐性检验。试验数据均以平均数±标准差（Mean±SD）表示。所有分析中以P＜0.05 代表差异显著。

2 结果与分析

62 份饲料样品中真菌毒素检测结果见表3。全部样品中AFB1、DON、ZEN、T-2、OTA 的检出率分别为43.54%、90.32%、93.55%、69.35%、74.20%。

根据国家卫生标准GB13078-2001（2001）[14]、GB13078.3-2007（2007）[15]、GB13078.2-2006（2006）[16]、GB 21693-2008（2008）[17]规定禽用饲料中AFB1、DON、ZEN、T-2、OTA 的最大允许量分别是20、5 000、500、1 000 和100 μg/kg。对照这些标准，62 份饲料样品中AFB1、DON、ZEN 的超标率分别是3.23%、16.13%、41.94%，T-2 和OTA 的超标率为0。

如表4 显示，东北、华北、华东地区AFB1的污染率分别为：42.11%、40.00%、47.83%。在污染水平方面，华东地区为（13.33±2.00）μg/kg，显著高于华北（8.45±3.28）μg/kg 和东北地区（5.90±1.46）μg/kg（P＜0.05）。

所有被检样品中，DON 的平均检出率为90.32%，其中华东地区污染率最高，达到95.65%。在污染水平方面，东北、华北、华东地区分别为（791.63±181.66）、（899.36±126.36）和（904.64±174.12）μg/kg，各区域之间无显著性差异（P＞0.05），见表5。

由表6 可以看出，东北、华北和华东地区丹顶鹤饲料中ZEN 的污染率至少为85.00%。其中，华东地区的污染率达100%。这3 个地区ZEN 污染水平分别为（573.93±94.41）、（515.53±43.26）和（720.66±101.95）μg/kg。

在3 个区域的被检饲料中，T-2 的污染率分别是68.42%、65.00%、73.91%。在污染水平方面，华北地区为（76.44±22.13）μg/kg 显著高于东北地区（P＜0.05），东北地区与华东地区以及华北地区与华东地区之间差异不显著（P＞0.05），见表7。

表3 被检饲料中真菌毒素污染情况Table 3 Contaminated levels of mycotoxins in all feeds

表8 显示，来自东北、华北、华东地区的饲料样本中OTA 检出率分别为：63.16%、75.00%和82.61%。在污染水平方面，东北、华北、华东地区分别为(16.12±4.83)、(15.15±4.30)和(12.30±2.76) μg/kg，各区域之间无显著性差异（P＞0.05）。

在本次检测5 种毒素中，62 份饲料样品里1 份含1 种毒素（DON），剩余61 份样品均含两种及两种以上的毒素（见表9），其中有21.31%的样品包含了全部5 种毒素；49.18%的样品污染了4 种毒素，在混合污染中所占比例最高；污染两种毒素的样品比例最少，为11.48%。

不同区域内丹顶鹤饲料中毒素构成情况各有不同（见图1）。在东北地区，同时含有5 种被检毒素的饲料比例最高，达到31.58%，其后是污染两种毒素（DON+ZEN）的饲料，占15.79%。而在华北地区，同时污染5 种毒素的饲料只有一份，占到该地区阳性样品数的5%。在该地区污染DON+ZEN+T-2+OTA的饲料最多，占40.00%。华东地区，污染AFB1+DON+ZEN+T-2+OTA 和DON+ZEN+T-2+OTA 的饲料比例较高，分别占到26.09%和34.78%。

表4 不同地区被检饲料中AFB1 的污染情况Table 4 Occurrence of AFB1 in red-crowned crane's feeds in different regions

表5 不同地区丹顶鹤饲料中DON 的污染情况Table 5 Occurrence of DON in red-crowned crane's feeds in different regions

表6 不同地区丹顶鹤饲料中ZEN 的污染情况Table 6 Occurrence of ZEN in red-crowned crane's feeds in different regions

表7 不同地区被检饲料中T-2 的污染情况Table 7 Occurrence of T-2 toxin in red-crowned crane's feeds in different regions

表8 不同地区丹顶鹤饲料中OTA 的污染情况Table 8 Occurrence of OTA in red-crowned crane's feeds in different regions

表9 丹顶鹤饲料中毒素的混合污染情况Table 9 Co-occurrence of mycotoxins in red-crowned crane's feeds

图1 不同区域丹顶鹤饲料中毒素组成Figure 1 Combinations of mycotoxins in red-crowned crane's feeds in different regions

3 讨论

出于公共食品安全以及相关经济利益方面的需要，在人类食品和畜禽饲料工业领域，真菌毒素污染问题得到了足够的重视[18]。世界上很多国家根据其掌握的不同毒素的毒物学资料、食品和饲料中毒素污染情况、分析方法的有效性及其自身的实际情况制定了不同食物和饲料中各主要真菌毒素的最大限量。而圈养野生动物饲料中的真菌毒素污染问题一直没有受到重视，也没有任何相关限量标准。美国农业部和食品药品管理局对人的食物和家养动物饲料中所含黄曲霉毒素的水平作出了限量标准[19]，然而毒素含量超过限量标准的谷物会被当做野生动物饲料进行出售[20]。S.E.Henke 等[21]对美国田纳西州野鸟饲料中的黄曲霉毒素污染情况进行调查后发现其中17%的被检样品中该毒素含量超过100 μg/kg，最高达2 780 μg/kg。虽然关于真菌毒素对野生动物危害的研究很少，但可以肯定食物中的真菌毒素能够导致野生动物的健康水平严重受损，甚至死亡[22]。

在黄曲霉毒素中AFB1被认为毒性最强，IARC[23]将其列为一类致癌物。各种动物对AFB1的敏感度均不相同，在禽类中，雏鸭最为敏感[24]。参考雏鸭对AFB1的敏感性，Liu D.W.等[13]推测当食物中该毒素浓度为6.2～11.4 mg/kg 时将导致丹顶鹤急性中毒。本次调查中丹顶鹤饲料中AFB1的污染水平远低于这个剂量。

黄曲霉毒素的污染一直是人们关注的热点。A.Zinedine 等[25]对摩洛哥市场上出售的禽饲料中AFB1污染情况进行调查，结果表明饲料中该毒素的最大值为5.38 μg/kg，平均浓度为1.26 μg/kg。T.Gazzotti等[18]对意大利超市出售的高档狗粮和中档狗粮中真菌毒素进行检测后发现这两种饲料中AFB1的水平均低于欧盟限量标准（5 μg/kg）。在本研究中AFB1的平均水平和最大值均高于以上两个地区的调查结果。在我国，禽类饲料中AFB1的限量标准为20 μg/kg（GB13078-2001，2001）[13]。按照这个标准，来自3 个地区的被检饲料中有两份毒素超标，其中华北、华东各1 份，含量分别为22.46 和23.16 μg/kg。在平均水平方面，华东地区显著高于其他两个地区，这可能与该地区降雨量较大、平均气温偏高等气候因素有关。

DON 和ZEN 是几种在自然界分布较广泛的镰刀菌属真菌产生的主要毒素[26-27]。只要气候条件合适，农作物在田间就可以感染相关的产毒真菌，因此农产品很容易被这两种毒素污染[28]。在本研究中我们也发现，与其他3种被检毒素相比，丹顶鹤饲料中DON、ZEN 的污染率较高，3 个地区的平均污染率达到85%以上，尤其是华东地区。从受污染程度来看，3 个地区被检饲料中没有样品的DON 浓度超过国家限量标准（5 000 μg/kg）。而ZEN 的污染较为严重，被检的3 个地区ZEN 的平均含量均超过国家限量标准（500 μg/kg）。周闯等[29]对全国部分地区禽全价料中真菌毒素进行调查，其中DON 和ZEN的检出率分别为88.24%、76.92%。本研究结果与这个报道类似。2003 至2005 年间，E.M.Binder 等[30]对世界范围内真菌毒素调查后发现，亚洲、大洋洲成品饲料中DON 和ZEN 的污染率分别为36.5%、38.3%，平均含量分别为634 和366 μg/kg；欧洲及地中海地区DON 和ZEN 的污染率分别为56.5%、27.1%，平均含量分别为290 与144 μg/kg。与此相比较，丹顶鹤饲料中DON 和ZEN 无论是污染水平还是在污染率均较高。

T-2 的毒性作用范围较广，对植物、细胞培养物、真菌、原虫等都能造成一定的危害。世界各国对该毒素的重视程度不同，有些国家对这种毒素进行了限定，而有些国家（如欧盟、加拿大）则采取了较为谨慎的做法，没有规定法定允许量或执行限量，仅以指南或建议的形式提出容忍量。我国的饲料卫生标准GB 21693-2008（2008）规定，禽配合饲料中T-2的含量不允许超过1 000 μg/kg，本次抽检的所有丹顶鹤饲料样品中T-2 含量均远小于国家限量标准。东北、华北和华东地区T-2 的平均污染率为69.35%，其中华东地区最高（73.91%）。与国内其他调查结果相比，这3 个地区丹顶鹤饲料中T-2 的污染率和污染水平均较小[31]。

我国配合饲料中OTA 的限量标准与欧盟的规定一致（100 μg/kg）。本次调查中，OTA 的污染率为74.20%，无被检样品超出限量标准。S.Achille 等[32]对意大利北部的家禽饲料调查发现，OTA 的污染率为100%，阳性样品中毒素含量的范围是0.04～6.50 μg/kg，超标率为0。对西班牙的饲料调查表明，家禽和蛋鸡饲料中OTA 的污染率分别是42.9%、37.5%，污染的平均水平分别是0.05 与0.52 μg/kg，超标率均为0[33]。与这些国家禽类饲料中的真菌毒素调查结果相比，虽然所有被检丹顶鹤饲料样本中无OTA 超标，但值得注意的是这些饲料中该毒素的平均污染水平偏高。

与国内畜禽饲料相比，东北、华北、华东地区丹顶鹤饲料中真菌毒素的污染率以及污染水平均不高，且大部分样品中毒素含量低于国家限量标准。但是，这些限量标准均是基于真菌毒素对生命周期较短的家禽、家畜的影响而制定。在大多数情况下，低水平的毒素不会导致直接的临床症状，然而它们都会对细胞、组织以及器官产生严重的损伤，加速肿瘤发生、发展的过程[34]。长期食用被真菌毒素污染的食物或饲料会导致严重的胃肠道疾病和恶性肿瘤[4，35]。因此，使用畜禽饲料中真菌毒素的限量标准来判定生命周期较长的野生动物饲料是否合格显然不合适。而且，对于鹤类来讲，其免疫系统可能没有其他禽类发育的完善[36]，同样水平的真菌毒素对丹顶鹤健康造成的危害可能会更大。如果长期食用含低水平毒素的饲料可能会造成慢性中毒，增大其对病原微生物的易感性。

食物或者饲料往往同时感染多种真菌，一种真菌一般会产生多种毒素[37]，在实际研究中发现多种真菌毒素混合污染的现象非常普遍[38]。因此，当人和动物受到真菌毒素威胁时，一般是来自多种毒素而不是单独的某一种毒素[39]。本次调查中也发现丹顶鹤饲料中真菌毒混合污染的比率非常高，62 份被检饲料中有61 份被两种及两种以上的毒素污染，混合污染率为98.41%，且被调查的3 个地区丹顶鹤饲料中混合污染的毒素种类数均较多。这种高混合污染率的情况与在其他国家调查的结果相类似[40-41]。由于不同的毒素作用的器官和组织不同，因此混合污染会对动物产生危害是多方面的，对机体造成的危害程度也远比单一毒素大[42]。丹顶鹤饲料中毒素混合污染情况尤其值得各饲养机构的重视。

真菌毒素污染可发生于饲料及饲料原料生产的任何一个环节，而且在饲料制作时的高温不能够将其中污染的毒素灭活。对于圈养野生动物来说，人工投喂的饲料是其唯一的食物来源。饲料中真菌毒素对野生动物的健康产生直接危害，影响珍稀动物种群扩大。本次调查表明，丹顶鹤饲料普遍受到真菌毒素污染，为减轻毒素对动物机体造成的不利影响，各丹顶鹤饲养机构可以从原料采购、仓储保管、存放周期、加工除毒素、提高动物机体免疫力等方面着手做好防范[43-44]。

4 小结

①中国部分地区圈养丹顶鹤饲料中，AFB1、DON、ZEN、T-2 和OTA 的污染率分别是43.54%、90.32%、93.55%、69.35%、74.20%。平均含量分别是7.62、871.49、616.34、65.62、14.50 μg/kg。其中，华东地区样品中AFB1的含量显著高于其他两个地区；华北地区样品中T-2 的含量显著高于东北地区。在超标率方面，AFB1、DON、ZEN 的超标率分别是3.23%、16.13%、41.94%，T-2 和OTA 没有超标。

②在抽检的62 份饲料样品里61 份含有2 种及2 种以上的毒素。其中，有21.31%的样品包含了全部5 种毒素，49.18%的样品污染了4 种毒素，18.04%的样品污染了3种毒素，11.48%的样品污染了2 种毒素。东北地区饲料中同时含有5 种被检毒素的饲料比例最高。华北地区饲料中污染DON+ZEN+T-2+OTA 的饲料比例最高。华东地区饲料中污染DON+ZEN+T-2+OTA 的饲料的数量最多。