MicroRNA-136-5p靶向STAT3调控对脊髓损伤大鼠炎症因子的影响*

吴楠，王涛，马剑雄，吕工一，马信龙

（1.天津医院 脊柱外科，天津 300211；2.天津市中西医结合骨科研究所，天津 300050；3.天津医院 骨外科，天津 300211）

脊髓损伤是临床上一种较为常见的运动系统创伤，对患者的中枢神经产生损害，导致患者发生不同程度的肢体瘫痪或者丧失劳动能力。近年来脊髓损伤的发生率逐年提高[1]。脊髓损伤包括原发性和继发性损伤，其中原发性损伤为不可逆的损伤，继发性损伤是在原发性损伤发生后逐渐形成的损伤，伴随着自由基损伤、炎症反应、细胞凋亡等基因表达和细胞代谢的改变，继发性损伤对人体产生的危害甚至会大于原发性损伤[2]。有研究表明[3]，脊髓损伤发生后体内基因的改变参与病理变化过程。microRNA（miRNA）属于生物体内较短的非编码单链小分子RNA，生物信息预测miRNA可至少对人类30%的蛋白质编码基因的表达进行调控，miRNA的发现为临床上多种疾病的治疗及机制研究提供了新的方向。研究显示[4]miRNA可通过调控信号转导和转录激活子3（STAT3）通路，参与多种疾病的调控，其中STAT3属于JAK-STAT信号通路中的核转录因子，当其被激活变为磷酸化STAT3（p-STAT3）后，一方面参与细胞的增殖、凋亡过程，另一方面可对免疫进行调节，在脊髓损伤疾病的发生、发展中有较重要的作用。目前对miR-136-5p靶向STAT3调控对脊髓损伤大鼠炎症因子的影响研究较少，本文就该课题进行研究，为临床上脊髓损伤的治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取60只SD健康大鼠，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，月龄3～6个月，平均（4.2±0.5）个月，体重 200～250 g，平均（224.6±6.5）g。所有大鼠养殖于干净笼子里，室温（22.1±1.8）℃，相对湿度35%～40%，每天光照12 h，喂饮纯净水，饲养时间为1周。本实验获得天津医院医学伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

miRNA-136-5p载体购自北京合生基因科技有限公司，大鼠脊髓神经元细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，小鼠抗大鼠白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白细胞介素-21（IL-21）、白细胞介素-23（IL-23）、白细胞介素-17（IL-17）抗体购自北京义翘神州科技有限公司，兔抗小鼠STAT3、p-STAT3抗体购自深圳欣博盛生物科技有限公司，兔抗大鼠肿瘤坏死因子 -α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）抗体、HE 染色剂、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 慢病毒载体构建 miR-136-5p 表达抑制的慢病毒载体构建及大鼠miR-136-5p的序列查找和设计由广州易锦公司完成。重组的LV-miR-136-5p和LV-sponge（抑制载体）慢病毒表达载体由广州易锦公司合成，并经测序验证。行慢病毒滴度检测，制备完成后重组慢病毒置入-80℃冰箱冷冻保存。

1.3.2 分组及模型复制 将60 只大鼠按照完全随机法分为对照组、脊髓损伤组、沉默组及过表达组，每组15只。脊髓损伤组、沉默组、过表达组大鼠复制脊髓损伤模型，对照组在模型复制期间不做任何处理。原发性脊髓损伤模型复制方法[5]：使用3%戊巴比妥钠注射于大鼠腹腔做麻醉处理，剂量为30 mg/kg，暴露出大鼠T12～L1节段硬脊膜，在离大鼠脊髓10 cm高度处以自由落体方式使用5 g冲击杆沿垂直冲击通道对大鼠T13节段以下脊髓进行打击，大鼠立刻出现尾巴、躯干痉挛性摆动及双下肢回缩样扑动，且大鼠苏醒后出现弛缓性瘫痪、排尿功能障碍。模型复制成功后，将10 μl miR-136-5p慢病毒悬液(病毒滴度为108TU/ml）在无菌环境下注射于沉默组、过表达组大鼠脊髓损伤区。对照组、脊髓损伤组大鼠注射等量的生理盐水。

1.3.3 运动功能、脊髓神经功能评价 使用 Beattie、Bresnahan、Basso（BBB）评分对4组大鼠运动功能进行评价，评定前排空大鼠膀胱，上午10：00由3位实验人员通过双盲法进行，取平均值。评价内容包括关节运动、运动协调、行走、躯干稳定性，满分21分，分数越高说明大鼠运动功能越正常，21分表示大鼠运动功能正常。使用联合行为评分法（combined behavioral score,CBS）对4组大鼠脊髓神经功能进行评价，评价内容包括大鼠运动功能分级、脚趾触地反应能力分级、端正体位反射、回缩反应能力分级、伸展能力分级、游泳实验、斜板实验等，满分为100分，分数越高说明大鼠脊髓神经功能障碍越严重，100分表示大鼠后肢功能完全丧失，0分表示大鼠脊髓神经功能正常。

1.3.4 组织切片及染色 4 组大鼠全身麻醉处理后，采用断头法处死，在无菌、低温条件下取大鼠损伤节段脊髓组织，对照组大鼠取与其他3组大鼠相对应节段的脊髓组织，大鼠肾组织在4%多聚甲醛中浸泡、固定，4℃环境下保存，使用二甲苯进行常规脱蜡处理2次，5 min/次，然后在梯度酒精下脱水处理3 min，自来水冲洗1次；使用苏木精染色5 min，自来水冲洗1次；使用浓度为1%的盐酸酒精分化处理30 s，在0.2%氨水中返蓝处理2 min，自来水冲洗1次；0.5%浓度伊红染色10 min，自来水冲洗1次；使用乙醇梯度脱水处理，常温下使用15% EDTA脱钙，脱水后进行石蜡包埋，制作3 μm厚的组织切片，最后用中性树胶进行封片，光学显微镜下观察大鼠脊髓的病理改变。

1.3.5 酶联免疫吸附试验检测 IL-6、IL-21、IL-23表达水平 大鼠模型复制前和复制2 h后取股静脉血2 ml，保存。将采集到的标本用50 mmol碳酸盐包被缓冲液进行抗原溶解，浓度为10～20 μg/ml，按100 μl/孔加入96孔酶标板中，4℃过夜保存。第2天舍弃包被液，磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗涤3次，每孔中加入1%的BSA 150 μl，在37℃环境中封闭1 h。PBST洗涤3次，每孔中加入100 μl不同倍比稀释度的血清，加入对照样品，37℃孵育2 h。采用PBST洗涤5次，加入100 μl稀释后的HRP标记的二抗，37℃孵育1 h。PBST洗涤5次，显色剂显色20 min后，在酶标仪上读取A405吸收值。

1.3.6 Western blotting检测脊髓组织 STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量 将采集到的标本用PBS清洗3遍以上，分离PBS，加入IP细胞裂解液，裂解35 min，提取总蛋白，蛋白质定量（BCA法）检测蛋白浓度。取20 μg/孔蛋白质，通过10%的SDS-PAGE进行电泳，加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白缓冲液15 min；100 V，电泳10 min，结束之后，将电转膜浸泡在10%的牛奶中，37℃环境下的摇床上封闭1.5 h；与一抗结合，加入TBST稀释，按1∶1 000稀释一抗Tubuli（n内参照），4℃孵育过夜保存；第2天用TBST缓冲液清洗，与二抗结合在室温下孵育1 h，再次用TBST缓冲液反复清洗。最后加入显影剂将其浸在底物溶液中显色，严格按照显影定影试剂盒说明书进行操作。

1.3.7 实时荧光定量聚合酶连反应检测 IL-17 mRNA表达水平 在无菌环境下取大鼠脊髓组织，使用Trizol法提取组织RNA，总反应体系20 μl，42℃水浴60 min，70℃、5 min终止反应，逆转录合成第一链cDNA。取1 μl逆转录产物cDNA作为反应模板，总反应体系为20 μl，IL-7正向引物序列：5'-GTGTC TCTGATGCTGTTG-3'；反向引物序列：5'-AACGGTTG AGGTAGTCTG-3'，产物大小为452 bp。退火温度为57℃，95℃预变性 5 min，60℃退火 30 s，72℃延伸40 s，共35个循环，72℃继续延伸 10 min。取 6 μl PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统下观察并采集图片，用Image J软件对图像进行灰度分析。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠运动功能、脊髓神经功能评分比较

4组大鼠BBB评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05），脊髓损伤组、沉默组、过表达组大鼠BBB评分低于对照组（P＜0.05），沉默组大鼠BBB评分高于脊髓损伤组、过表达组（P＜0.05）；4组大鼠CBS评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05），脊髓损伤组、沉默组、过表达组大鼠CBS评分高于对照组（P＜0.05）；沉默组大鼠CBS评分低于脊髓损伤组、过表达组（P＜0.05）。见表1。

2.2 4组大鼠脊髓的病理组织学变化

对照组大鼠无脊髓损伤，神经细胞形态正常，胶质细胞分布均匀；脊髓损伤组、沉默组、过表达组大鼠存在明显的脊髓损伤，损伤部位结构丧失，仅有少量的神经细胞数目，存在细胞浸润；过表达组大鼠脊髓损伤较沉默组大鼠严重，神经细胞形态异常，胶质细胞大量增生。见图1。

表1 4组大鼠运动功能、脊髓神经功能评分比较（n =15，±s）

表1 4组大鼠运动功能、脊髓神经功能评分比较（n =15，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与沉默组比较，P ＜0.05。

组别 BBB评分 CBS评分对照组21.00±0.00 0.00±0.00脊髓损伤组2.67±0.25①② 89.65±3.56①②沉默组3.26±0.38① 65.32±1.67①过表达组2.01±0.12①② 95.68±4.62①②F值 13.827 6.006 P值 0.001 0.001

2.3 4组大鼠脊髓组织IL-6、IL-21、IL-23表达水平比较

4组大鼠脊髓组织IL-6、IL-21、IL-23表达水平的比较，差异有统计学意义（P＜0.05），脊髓损伤组、沉默组、过表达组大鼠脊髓组织中IL-6、IL-21、IL-23表达水平高于对照组（P＜0.05），沉默组大鼠脊髓组织IL-6、IL-21、IL-23表达水平低于脊髓损伤组、过表达组（P＜0.05）。见表2。

2.4 4组大鼠脊髓组织STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量、IL-17 mRNA表达水平比较

4组大鼠脊髓组织STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量、IL-17 mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），沉默组大鼠脊髓组织STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量、IL-17 mRNA表达水平均低于对照组、脊髓损伤组及过表达组（P＜0.05）。见表3和图2。

图1 4组大鼠病理组织学切片图（HE×200）

表2 4组大鼠脊髓组织IL-6、IL-21、IL-23表达水平比较 （n =15，pg/ml，±s）

表2 4组大鼠脊髓组织IL-6、IL-21、IL-23表达水平比较 （n =15，pg/ml，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与沉默组比较，P ＜0.05。

组别 IL-6 IL-21 IL-23对照组78.26±2.28 53.21±2.31 20.02±1.65脊髓损伤组87.56±1.25①② 72.13±3.00①② 30.49±1.01①②沉默组80.12±3.16① 63.23±1.68① 22.16±2.06①过表达组95.38±4.67①② 75.89±4.12①② 40.26±3.28①②F值 19.138 27.895 32.025 P值 0.001 0.001 0.001

图2 4组大鼠脊髓组织中STAT3、p-STAT3蛋白表达水平

表3 4组大鼠脊髓组织STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量、IL-17 mRNA 表达水平比较 （n =15，±s）

表3 4组大鼠脊髓组织STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量、IL-17 mRNA 表达水平比较 （n =15，±s）

注 ：†与沉默组比较，P ＜0.05。

组别 STAT3 p-STAT3 IL-17 mRNA对照组1.00±0.01† 1.00±0.05† 1.00±0.01†脊髓损伤组1.10±0.05† 1.21±0.07† 1.13±0.10†沉默组0.10±0.02 0.37±0.01 0.24±0.01过表达组1.23±0.16† 1.36±0.12† 1.35±0.12†F值 8.335 16.088 16.886 P值 0.001 0.001 0.001

3 讨论

脊髓损伤发生后机体会出现原发性脊髓组织坏死、细胞溶解、继发性损伤等，患者中枢神经系统受到损伤，损伤面以下的运动感觉功能、括约肌功能完全丧失或者不完全丧失[6]。患者神经元会大量坏死、发生局部免疫炎症反应及缺血性水肿，目前临床上常手术联合药物治疗此病，以减轻继发性损伤，但疗效均不理想，患者预后较差。

近年来随着对miRNA生物学功能机制的不断深入研究，在多种动植物、微生物中发现多达17 000个miRNA，和人类相关的miRNA包括1 000多种，为临床多种疾病诊断、治疗及预后提供新的方向[7-8]。有研究认为[9-11]，当机体处于正常生理条件下，miRNA能够对正常免疫功能进行调节，当机体生理条件异常时，miRNA参与机体应激反应，miRNA表达出现异常，对紊乱的机体功能进行调节，通过一系列的作用，导致自身免疫性疾病的发生。有研究表明[12]，miRNA可参与机体细胞增殖、凋亡、免疫反应、炎症反应等生理过程和疾病的发生过程。徐宏博等[13]认为miRNA与多种中枢神经系统类疾病相关，包括帕金森综合征、阿尔兹海默病等。miRNA是一类长19～25个核苷酸的非编码RNA，通过靶向靶基因3'-非编码区，进而对靶基因的表达进行抑制[14]。研究表明[15-16]，miRNA可通过靶向调控STAT3通路，对细胞炎症反应、细胞增殖、凋亡进行调节。

STAT3属于STAT家族成员，是一种转录因子，能够调控基因的表达。STAT3位于染色体17q21区域，为DNA结合蛋白酶，能够对表皮细胞生长因子的刺激产生反应。当STAT3磷酸化后会导致STAT3二聚化、易位至细胞核中，与DNA结合，参与机体的炎症反应[17-18]。目前有研究报道[19]，Th17细胞分化与IL-6、IL-21、IL-23相关，可在丝氨酸激酶或者YAK的诱导下转化为p-STAT3，之后形成二聚体并进入至细胞核，和IL-17的启动子相结合，对其进行调节、转录，最终促进Th17细胞的分化。有研究表明[20]，STAT3的过度表达与Th17细胞的分化相关。本研究中，对4组大鼠脊髓组织IL-6、IL-21、IL-23表达水平及STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量、IL-17 mRNA表达水平进行检测，结果显示，沉默组大鼠脊髓组织IL-6、IL-21、IL-23表达水平及STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量、IL-17 mRNA表达水平均低于过表达组大鼠，该结果提示miR-136-5p可通过靶向STAT3，抑制STAT3磷酸化，作用于Th17细胞，对Th17细胞炎症因子水平进行调控，进而抑制炎症反应。

综上所述，脊髓损伤后miR-136-5p沉默可抑制STAT3的表达，进而抑制炎症因子的过度表达，最终抑制脊髓炎症反应。

目前关于对miR-136-5p靶向调控STAT3的研究尚未有报道，本文研究了miR-136-5p靶向STAT3调控对脊髓损伤大鼠炎症因子的影响，为临床上脊髓损伤的研究提供了新的方向。