癌症进化发育学的新证据：结直肠癌和肝细胞癌的研究发现

丁一波 陈一凡 曹广文

作者单位：200433上海 海军军医大学海军流行病学教研室

恶性肿瘤目前居人类非成熟死亡（在人群平均寿命之前的死亡）原因第一位。绝大多数癌症的发生和发展依赖于慢性炎症。慢性感染、环境暴露和免疫失衡会引起宿主慢性非可控性炎症，而慢性炎症为癌症发生提供微环境并影响其发展全过程。癌症发生发展过程既体现了“变异-选择-适应”的进化过程，又存在与发育相反的“退化”过程。通过对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）致肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）内在机制的深入研究，并结合其他肿瘤二代测序研究结果，本团队在国际上首次提出了“癌症进化发育学（Cancer Evo-Dev）”理论框架［1-7］。该理论框架基本内容如下：在癌症早期发生阶段，癌前病变组织中某些细胞通过炎症诱导核酸编辑酶表达，产生了体细胞变异，改变了原有细胞信号模式；通过炎症微环境的进化选择，少数变异细胞生存下来，发生去表观遗传修饰（如去甲基化）的去分化过程，然后由上皮细胞向间质细胞转化，即EMT过程，从而赋予这些细胞克服“衰老”、掠夺营养、获得无限扩增的能力，其中部分细胞进一步进化，被赋予了侵袭潜能。在“变异-选择-适应”的进化过程中这些癌症相关的共性或特性体细胞变异、信号网络在癌症进化发育中起决定作用。从癌前病变到癌症发生及早期侵袭等癌症进化发育过程中，存在表观遗传修饰、体细胞突变、动态信号网络调控等系列分子事件。本文选择结直肠癌（colorectal cancer，CRC）和HBV相关性肝细胞癌（HBV-HCC）两种我国恶性肿瘤负担较重且具有炎-癌转化特征的代表性恶性肿瘤，阐述其发生和侵袭过程中的早期关键分子事件，以期确定何种癌前病变更易恶化以及何种癌症更容易发生早期侵袭，从而实现CRC和HBV-HCC特异性预防和治疗“关口前移”的目标。

1 HLA-Ⅱ抗原和NF-κB等炎症信号的遗传易感性与慢性炎症的关系及其在癌症进化发育中的作用

1.1 炎症信号的遗传易感性与慢性炎症的关系

在HBV-HCC方面，既往研究表明免疫和炎症信号关键通路分子如人类Ⅱ类白细胞抗原（human leukocyte antigen classⅡ，HLA-Ⅱ）-DP，-DQ和-DR，以及STAT3、NF-κB先天单核苷酸多态性-遗传易感性与HBV感染慢性化相关。HLA基因先天遗传多态性的少见基因型（或等位基因）与HBV感染慢性化呈显著负相关，尤其在HBV基因型C感染者中关联性更显著［8-9］。研究发现提高NF-κB活性的遗传多态性有助于B型HBV清除，而rs2233406变异基因型可能通过促进HBV突变的免疫选择而显著增加HCC发病风险［10］。STAT3相关研究提示SNPs与HBV突变的相互作用使HBV突变的宿主更易发生肝癌［11］。

在结直肠癌方面，溃疡性结肠炎向CRC进化过程中，调节性T细胞（Treg）亚群IL-8+Foxp3+CD4+T细胞和KLRG1+T细胞增加，且两者具有免疫抑制和促炎的双功能活性［12］。同时，表观调控分子PRC2复合体和EZH阻滞T细胞进入转化微环境，可强化免疫抑制网络形成［13-14］。

综上认为，在某些遗传因素主导的遗传倾向下，外部环境的持续刺激是产生和维持慢性炎症的基础。以社区为基础的流行病学研究对研究遗传因素和环境因素在癌症病因中的作用是不可替代的［15］。因此，病因学研究应该加强流行病学、遗传学、免疫学、分子生物学和临床医学之间的联系。

1.2 炎症信号分子通过影响免疫HBV功能，从而影响对HBV变异的选择作用

HLA-Ⅱ抗原基因的先天遗传多态性以及在乙型病毒性肝炎致癌过程中起决定性作用的炎症信号通路STAT3和NF-κB等关键分子基因的先天遗传多态性决定了免疫系统参与的炎症反应，对HBV特征性变异具有明确的选择作用。这些HLA-Ⅱ类免疫基因以及STAT3和NF-κB等炎症信号网络关键分子的主要遗传多态性不但影响HBV感染的慢性化，还可促进HCC相关HBV的变异选择，体现了遗传因素通过基因功能影响对环境致癌因素的“优化”过程［4］。在“HBV携带-慢性HBV-肝硬化-HCC”发展过程中，HCC相关HBV高危突变逐渐积累但是T细胞受体多样性却逐渐降低。影响免疫如人类Ⅱ类白细胞抗原基因HLA-DR表达的遗传多态性可显著降低高危HBV突变A1762T/G1764A的频率，并降低HCC发生风险［16］。

1.3 慢性炎症在癌症进化发育的早期共性和特性关键分子事件

本团队比较了外周血、癌旁肝组织和HCC组织中的HBV序列，发现HBV突变的复杂程度在外周血-癌旁肝组织-HCC组织中逐渐降低，但高危突变比例上升，呈现出典型的环境筛选特征。在肠道炎症或腺瘤向CRC进化过程中，真菌菌群出现多样性和构成的特征性筛选；白色念珠菌具有异常活化肠上皮Wnt/β-catenin信号通路和抑制趋化因子CXCL10等表达的“双向”调控活性，是慢性炎症促进癌症发生的关键分子事件［17］。

近期有研究利用多种致病肝纤维化动物模型证实LECT2-Tie1、Slit2-Robo1信号可调控肝硬化进程的早期肝纤维化过程［18］。基于胎肝的相关研究表明胚胎期活跃的MBNL3-lncRNA-PXN调控网络是HBVHCC发生的早期关键事件，进一步证实HCC发生的早期分子事件与肝脏组织的胚胎期发育事件密切相关［19］。慢性乙型病毒性肝炎患者外周血CD4+和CD8+T细胞中miR-155表达水平显著升高，且可能与免疫活化呈正相关［20］。研究认为一些新发现的关键分子有望为癌症的早期诊断提供新的生物分子标志物［21-22］。可见癌症发生早期分子事件大多与炎症相关分子及早期胚胎表达分子有关。

2 慢性炎症促进癌前病变向癌症转化的关键分子事件

2.1 APOBECs家族是连接慢性炎症和癌症的桥梁

癌症的发生发展是慢性非可控性炎症环境下的进化发育过程，同自然环境下物种的进化一样遵循着“变异-选择-适应”的进化规律。载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽（apolioprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide，APOBEC）家族是一类高效的胞苷脱氨酶，其转录可被促炎症细胞因子和趋化因子激活，并在固有免疫和抗体产生等获得性免疫机制中发挥重要作用。APOBECs家族通过致突变抑制病毒复制的同时，也可驱使有促癌作用的病毒突变体形成，其基因编码功能还可诱发有促癌作用的驱动突变产生。作为在炎-癌转化中发挥桥梁作用的标志性酶，APOBECs家族对癌症的进化发育至关重要，是贯通炎-癌转化过程的突破点［1］。

2.2 尿嘧啶DNA转葡萄糖基酶

与APOBECs相互保持“促突变-修复”平衡的是尿嘧啶DNA转葡萄糖基酶（UNG）。UNG通过减少由G∶C到A∶T过渡突变引起的诱变事件，在维持基因组完整性方面起关键作用。UNG启动了下游的多种修复通路，在消除突变C＞U的同时亦会产生少部分其他突变。如UNG切除尿嘧啶形成AP位点后，可在互补链合成时在没有模板的情况下插入碱基，若再次插入鸟嘌呤，核酸链可修复到正常状态；若插入腺嘌呤则会形成C/G到T/A突变。事实上，后者常常发生，这亦是APOBECs的特征性标签之一。同时，核内亚型（UNG2）主要集中于细胞分裂G1期，意味着“突变-切除-修复/降解”的代谢更频繁，对癌症起始细胞等分裂旺盛的细胞起突变积累加速作用［7］。

2.3 APOBECs和UNG如何维持平衡

APOBECs与UNG的平衡关系主要体现在以下3个方面：⑴UNG可识别APOBECs家族引起C＞U突变，并切除尿嘧啶，形成AP位点；⑴UNG包括线粒体亚型（UNG1）与UNG2两类，其中UNG2活性更强，这与APOBECs清除进入细胞核的HBV cccDNA以及对人体基因组的诱变功能相对应；⑶APOBECs家族对单链DNA脱氨基活性是双链DNA的200～300倍，UNG2对单链DNA的尿嘧啶切除活性较双链DNA高50倍。但是，UNG和APOBECs平衡作用的效果并不只是简单的相互制约、相互抵消，而是既牵制又配合［3-5，23］。

2.4 APOBECs和UNG的启动子和增强子SNP在炎-癌转化中的作用

“阴”和“阳”炎症因子可以诱导APOBECs和UNG失衡，进而影响炎症致癌过程。转录调控区域的SNP基因型rs2267401：APOBEC3B promoter（-338 bp：T→G）和rs3890995：UNG enhancer（-1 948 bp：T→C）可加强由“阴”性细胞因子IL-6引发的基因损伤-修复失衡，增加病毒突变概率，从而增加癌症发生风险［23］。腺瘤性息肉组织中APOBEC3B的表达水平显著高于正常组织，达到CRC组织水平，并显著富集了APOBEC标签性突变。在HBV慢性致癌的进化前期阶段（慢性肝炎、肝硬化），炎症因子上调的APOBEC可促进HBV基因组产生APOBEC相关突变，这些突变显著增加HCC发生风险。研究发现激活炎症通路，在HCC和CRC中均可显著上调促进基因突变的胞苷脱氨酶APOBECs家族的表达［23］。

3 原位癌向早期侵袭进化的关键分子事件

“癌症进化发育学”理论阐述了驱动癌症进化的关键分子事件通过调控“干性”信号通路、诱导以上皮细胞向间质细胞转化为代表的逆向进化、改变能量代谢模式、影响微环境等方式赋予肿瘤细胞生存优势，使其适应炎症选择压力，不断进化从而导致侵袭发生。

3.1 “干性”信号通路调控促进早期侵袭

研究发现，Cortactin和Prohibitin过表达可调控CRC细胞形成侵袭性伪足［24］；KRAS突变可抑制IRF2表达，从而抑制CXCL3-CXCR2轴，使髓源抑制细胞增多，进而抑制免疫反应和T细胞浸润，促进CRC演进［25］。在HCC中也明确了一批通过调节各类干性信号通路而显著促进HCC进化的关键分子事件，包括显著富集在mTOR信号通路的HBV整合突变，激活SATA3信号通路的PRMT1，缺氧诱导的14-3-3ζ、ICR和ICAM异常上调［26］、lncRNA-FTX异常下调以及Bif-1介导的CDC42上调［27］。这些关键的信号分子均在癌症“发育”过程中具有重要作用。

3.2 EMT促进早期侵袭

EMT指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。研究表明，FOXF1、TUSC3诱导的WNT/β-catenin和MAPK信号通路激活，miR-20a/miR-106a介导的WTX缺失均可促进EMT，进而促使CRC发生侵袭［28］。在HCC中，低表达miR-26a的巨噬细胞通过分泌TGF-β促使HCC细胞出现EMT，而CD31通过ITGB1-FAK-Akt信号通路诱导EMT，两者均可促进HCC转移和侵袭［29］。其他研究显示，肿瘤外泌体lncRNA能促进HCC和CRC侵袭［30-31］。综合国内外研究结果，有望发现突变致癌导致“逆向分化”的分子标志和靶向干预的关键分子。

3.3 炎症微环境和微生物促进早期侵袭

研究发现，miR-25-3p通过外泌体从肿瘤细胞转移到血管内皮细胞中，可促进肿瘤血管形成及增加血管通透性，进而推动转移前微环境的形成，而检测外周血循环外泌体的miR-25-3p表达水平可预测CRC远端转移［32］。肠道菌群刺激产生的cathepsin K通过调节TLR4依赖的M2型巨噬细胞极化而促进CRC侵袭和转移［33］。其中特异性菌株可作为预测免疫治疗效果的生物标志物，相关菌群制剂以及菌群移植等肠道菌群干预方式有望成为肿瘤免疫治疗的辅助手段［34］。

4 小结

本文在炎-癌转化研究中，从慢性炎症和癌症的遗传易感性角度出发，如人类Ⅱ类白细胞抗原（HLA-DP、-DQ、-DR）和炎症相关基因表达与功能的遗传易感性对维持慢性非可控性炎症的作用等，利用流行病学各类大规模人群队列研究，建立了病因学时间序列上的联系，深入研究从“慢性炎症-癌前病变-原位癌-侵袭癌”这一完整的发生发展过程中出现的各类“免疫-选择-适应”现象和关键分子事件。发现了与CRC和HCC发生和侵袭相关的分子均与促进基因突变的APOBECs和变异修复的UNG间的平衡有关，因而提出APOBECs与UNG之间的平衡是促癌突变的重要步骤，是炎症转化的桥梁。还发现炎症微环境同样可促进分化细胞发生去分化，具体表现在表观遗传修饰逐渐被去除，促使EMT发生，分化细胞向早期非分化的干细胞进一步“退化”，呈现“逆向发育”过程。这些发现也进一步丰富了癌症进化发育学各层级证据并完善了“癌症进化发育学”理论体系。“癌症进化发育学”理论体系今后仍需不断完善，目前的证据支持“癌症进化发育学”理论的真实性，有望利用“癌症进化发育学”原理和方法，指导癌症防治具体实践，如确定何种癌前病变人群更易发生癌症，找出癌症特异性预防措施；确定何种早期癌症会出现早期侵袭，从而开展针对性治疗以降低癌症病死率，避免过度医疗。