基于细胞培养的动物性蛋白质的生产细胞农业研究进展

李 卫,谭 蒙,孙 莉,张迎庆

(湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北武汉 430068)

人们对肉奶等动物性蛋白质消费需求的日愈增长给地球资源和自然环境造成了很大压力[1]。大规模的畜禽饲养会对水资源、土地资源造成压力,畜禽排泄物会对水源、土地及空气产生污染[2]。此外,传统畜牧业还存在食品安全问题,例如沙门氏杆菌、大肠杆菌等细菌的污染以及禽流感、疯牛病、口蹄疫等病毒的感染,这些都极大地威胁着人类健康[3],因此人类迫切需要可持续的动物性蛋白质的生产。

细胞农业是利用细胞培养技术,用比传统畜牧业少得多的动物或动物源性物质生产动物蛋白,即通过直接培养细胞获得在营养价值、外观、味道、物理特性等方面均与动物源一样的蛋白质产品,如胶原蛋白、蛋清液以及研究最多的“肌肉蛋白质”——培养肉等[4]。研究表明,细胞农业生产培养肉比传统畜牧业生产牛肉、羊肉、猪肉和禽肉的温室气体排放量减少了78%～96%、土地使用量减少了99%、水资源使用量减少了82%～96%、能源使用量减少了7%～45%[5]。通过采用标准化生产方法,细胞农业的生物和疾病风险会显著降低[6]。由于细胞农业不需要屠宰动物,因此可满足素食主义者以及那些出于人道而减少肉类摄入的杂食者的需求。此外,细胞农业对气候、土地质量和面积的依赖程度较低,可以使生活在气候恶劣、土地贫瘠地区的人们持续地获得动物蛋白[7]。

细胞农业的研究与开发始于2005年,但其突破性的进展是在2013年以后。2013年Mark Post教授生产出了世界上第一个人工培养的含有原代牛骨骼肌细胞的牛肉汉堡,并在当年8月的伦敦记者招待会上烹制和食用[8]。随后,总部位于美国的孟菲斯肉制品公司生产出肉丸、牛柳、鸡肉和鸭肉等培养肉示范产品,Modern Meadow公司生产出由肌肉细胞与水凝胶结合的高蛋白脱水食品——碎牛肉[9],另一家美国Finless Foods初创公司开展了培养鱼的研究[10]。2018年底,以色列宣称培育出人造牛排[11]。早在2017年中国就与以色列签署了3亿美元的贸易协议,购买其实验室制备的培养肉[12]。细胞农业按所使用的生产方法可分为两类,即基于组织工程的细胞农业和基于发酵的细胞农业,它们的共同特征是生产与传统牲畜业生物等效的产品。基于组织工程的细胞农业是从活体动物身上提取细胞或细胞系,通过组织工程技术产生肌肉等可利用的组织,培养肉的生产即属于该类[13]。基于发酵的细胞农业是通过使用重组DNA改造的细菌、藻类、酵母等微生物的发酵来生产动物性蛋白质,如明胶、酪蛋白、胶原蛋白等,它利用的是较为成熟的工业生物技术。美国国家科学院将基于细胞培养的动物性蛋白质的生产列为生物科学中具有高增长潜力的领域。2019年人造肉汉堡入选全球十大突破性技术[14]。全球肉奶类替代品市场预计将在2023年增长到64亿美元,未来五年培养肉行业的规模将增至100亿美元[15]。细胞农业产品与传统畜牧业产品在营养、味道及口感上几乎相同,既满足了消费者吃肉的愿望,又能确保食品安全及饮食营养,还减少了水的消耗、土地的利用、温室气体排放及水体富营养化等传统畜牧业所带来的环境负担。因此,细胞农业是一种可替代传统畜牧业、可持续发展的生产方式。本文探讨基于细胞农业进行培养肉等动物性蛋白质的生产过程、关键因素、安全监管及发展展望。

1 基于组织工程的细胞农业生产培养肉的过程及关键因素

1.1 生产过程

基于组织工程的细胞农业生产肉制品主要是利用动物体内分离得到的种子细胞,通过组织工程技术模拟胚胎肌肉的生成或创伤后肌肉组织的再生[16]。培养肉的生产分为两个阶段:a.细胞扩增阶段,即采用贴壁培养或微载体悬浮培养技术,在细胞增殖反应器中使未分化和半分化的细胞增殖以获得更多的种子细胞;b.分化阶段,通过将种子细胞接种到能提供三维生长依托的支架上,在组织灌注反应器中使其生长、分化、发育成肌肉细胞,再通过不断融合新的肌肉细胞形成多核肌管,多核肌管分化形成肌纤维,最终形成类似肌肉形态和生理特征的组织。培养结束后再将所得的肉糜加工成肉制品[17]。目前制备的培养肉没有血管和脂肪,肌血球素和铁蛋白的含量也很少,但与全植物仿肉制品相比,其外观、味道、口感及质地更近似于传统肉[18]。

1.2 细胞来源

培养肉的主要细胞来源是原代细胞和基因突变的细胞系。获得突变细胞系的方式有两种,一是采用基因工程或化学诱变法获得无限增殖细胞[19];二是从自发突变的细胞中筛选永生细胞[13]。原代细胞通常是干细胞,包括肌卫星干细胞、胚胎干细胞、间叶干细胞等[20]。肌卫星干细胞是培养肉最常用的细胞来源;胚胎干细胞由于具有无限增值能力也被作为细胞来源,但要使其仅朝着肌肉细胞进行分化比较困难;间叶干细胞因其繁殖能力高并能在无血清培养基中生长而被研究者青睐[21-22]。保证原代细胞在经过多个生产周期后不变异是降低培养肉生产成本的关键。最近的研究提出了一些解决方案,例如让细胞处于缺氧状态、调节支架参数等[23]。目前对于采用何种动物及取用哪个组织部位的细胞作为最佳的细胞来源仍然是争论最多的问题。

1.3 培养基的组成及其筛选技术

生产培养肉的培养基由糖类、氨基酸、油脂、维生素、矿物质等组成,在细胞生长的不同时期还需要添加一些生长因子,例如在细胞分化期常加入动物血清或鸡胚提取物,因为它们含有激素、脂肪酸、微量元素、胞外囊泡等多种生长因子[17,21,24]。由于含血清等动物源成分的培养基会产生污染、重复性差以及监管等方面的问题,因此开发无动物源成份的培养基是目前的研究热点[25]。细胞农业所用培养基十分昂贵,尚不能用于大规模的细胞农业生产,因此获得廉价培养基是细胞农业急需解决的问题。现在研究人员开发出一种多孔微流体装置,通过并行处理成百上千个不同组分的培养基并采用自动图像分析技术,能极大地加快培养基的筛选及研发过程[26]。

1.4 组织支架

为了模拟肌肉生长的天然环境、增强细胞的生长和分化、促进肌肉纤维的形成并使肌肉细胞附着其上生长,需要在反应器内放置支架。现今大多数成功制成的肉制品都是在动物来源的胶原蛋白支架上生长的,因其更接近肌肉的天然生长环境。为了生产高度结构化和组织化的培养肉,需要采用灌注法制备具有立体网络通道的支架,使液体能在整个网络组织中流通灌注,例如研究人员采用3D打印机制成的灌注网络支架能维持六周的细胞培养[27-29]。关于支架制造需要解决的问题还很多,例如制备可食用支架使其成为肉制品的一部分,制备可降解的支架,制备易与培养肉分离的可重复使用支架,用食品级非动物来源或动物源的生物材料制备支架等[30-31]。

1.5 生物反应器

要使培养肉在价格上能被消费者接受,首先必须提高反应器体积以降低生产成本。研究表明,反应器体积放大100 倍,可使单位产量的设备成本降低到原来的15.8%[32]。其次,细胞培养密度也要比目前动物细胞培养高一个数量级。这对于组织工程来说将是前所未有的挑战,因为高密度、大规模的细胞培养需要生长因子及营养物质的快速补充、氧气的充足供应以及代谢废物的快速排放[33]。

传统搅拌釜式或鼓泡塔式反应器只能生产碎沫肉,要想生产出高度结构化的培养肉(如整块牛排)需要采用“三维支架+灌注”式反应器。然而,由于其放大存在很大困难并不适合培养肉的大规模生产[34]并且随着“三维支架+灌注”式反应器内流动尺度的增加,灌注营养液产生的阻力会升高,甚至会在某些区域超出细胞的承受力而造成细胞死亡;对于大型“三维支架+灌注”式反应器来说,采用低灌注流速时其内部溶氧、温度、pH以及营养物传输和代谢废物的积累均会出现不均匀,而高灌注流速会导致剪切应力过高对细胞造成伤害[32]。因此,“三维支架+灌注”反应器的工程放大是培养肉产业化所面临的重要问题。

2 基于发酵的细胞农业生产动物性蛋白质

2.1 生产过程

基于发酵的细胞农业生产动物性蛋白质的过程与重组蛋白生产过程类似。首先将能表达所需蛋白质的基因导入宿主细胞,然后将此基因改造的宿主细胞置于装有培养基的生物反应器中生长繁殖,宿主细胞据该目标基因表达出对应的蛋白质,最后将产生的蛋白质与宿主细胞分离并对分离出的蛋白质进行纯化[35]。

基于发酵的细胞农业生产所用菌株与生产重组蛋白酶的菌株相似,因此可直接借鉴重组蛋白酶的研究成果及生产经验,例如蛋白质改性的精确控制、蛋白质的高效折叠等,这能极大地促进细胞农业的研发[36]。酵母菌、丝状真菌等长期安全地用于食品工业的微生物也正在被开发成细胞农业生产的宿主菌株。

2.2 生产特点及存在问题

基于发酵的细胞农业生产出的动物蛋白的分子量通常很大,由许多重复单元和亚基组成,在基因改造的非原生宿主细胞内,将它们进行最后组装十分困难,因此开发出能表达和组装复杂蛋白分子的微生物是现今面临的挑战。

与重组蛋白不同,基于发酵的细胞农业生产的蛋白质通常积累在细胞内而不是分泌到培养基中,这使得这类产品更易受到宿主细胞残骸的污染,产品的分离纯化变得更加困难。如果选择出能产生所需风味的宿主细胞且对产品纯度要求不高,将大幅降低细胞农业的生产成本。例如,酿酒酵母中含有能产生乳酪风味的菌株,将此菌株用于生产酪蛋白,存在于酪蛋白粗提物中的残留酵母细胞将对最终乳酪产品的风味具有重要贡献[37]。

2.3 生产的产品种类

目前,基于发酵的细胞农业生产的动物蛋白包括明胶、酪蛋白、胶原蛋白等,这些蛋白可以用于食品、皮革、生物医学和化妆品领域,如酪蛋白可用来制备牛奶,明胶可用来制备蛋清液,胶原蛋白可用来制备皮革、生物材料以及作为化妆品原料等。目前已有用发酵法生产出蜘蛛丝样的胶原蛋白用于纺织和生物材料方面的应用[37]。

基于发酵的细胞农业生产的动物蛋白的纯度通常要求不高,但不能含有活菌及抗性基因。考虑到成本因素,可以仅将对产品功能起重要作用的蛋白质用细胞农业生产的蛋白质取代,其它则由植物成分代替。例如,生产蛋清液只需包含10%的发酵法生产的蛋白质,其余部分用植物或藻类胶质物代替,即可生产出与天然蛋清差不多质地、功能、风味和营养成分的产品。将发酵法生产的动物蛋白与植物来源的蛋白质、油脂等结合,可生产出比全植物的仿制肉更接近动物肉制品的产品,并且可按需调节仿制肉中所含的营养组分,例如可以将其中含量较多的且对身体有害的ω-6脂肪酸用对身体有益的ω-3脂肪酸代替。

3 细胞农业生产的安全监管

3.1 培养肉的安全监管

2018年10月美国农业部食品安全与检验局(FSIS)和美国食品药品监督管理局(FDA)举行联合会议,就来自畜禽细胞培养食品的潜在危险、监督管理等方面进行讨论[38]。FDA认为细胞培养的可食性产品成分并不需要新的批准许可,因为现有的指南已经能够完全涵盖细胞培养的各种组分、外源性试剂、生产工艺等,而且作为食品成分的培养细胞及其代谢产物已经通过GRAS(Generally Recognized as Safe)安全认证并具有长期的安全消费历史。

有学者认为将培养肉与传统畜禽肉实质等同的监管模式是不合适的,作为安全审查的一部分,应该找到一些方法来确定培养肉是否符合与畜禽肉实质等同或无实质差异的标准[39],认为对培养肉的监管方式应该取决于其生产方式。欧盟于2015年修订的管理条例中也废除了实质等同的监管模式,而将危险性评价等预防性措施作为优先考虑因素[4]。

培养肉的安全监管涉及一系列管理部门。在欧洲,畜禽供体的养殖及其细胞的提取和检验涉及到动植物卫生署、食药局、环境部、农村事物部及当地政府机构等多个部门。培养肉本身也需要食药局、当地环境健康部门、贸易标准部门及当地政府机构的监管。为减少监管的复杂性,提倡采取主要权力模式,即在该领域具有专业资质的一家地方机构为代表行使其监管权力[40]。美国的FSIS和FDA签订了一项协议,以规范管理来自家畜细胞及细胞系的细胞培养食品,由FDA负责监管细胞采集、细胞库、细胞增殖和分化,而FSIS负责监管细胞收获、后续加工及销售等[41]。

由于细胞取自动物活体,因此建立动物福利法案十分必要[42-43]。目前关于供体细胞标准参照的是人体组织细胞医学管理条例,需要对其进行修订使其适用于培养肉生产。细胞农业生产肉制品是细胞培养技术与肉类科学的结合,在安全监管上应包括以下内容:关键致病菌的鉴定及防止污染的安全措施,确保肉的老化时间在24 h以上以使所有细胞死亡,监测每一阶段细胞的质量及功能(包括细胞效力的评价、基因稳定性检测等),代谢废物的处置及回收利用,生产车间的危险性及可操作性管理等[44-45]。

对于培养肉与传统畜禽肉混合的肉制品,应防止弄虚作假乱标两种肉比例的情况。研究人员正在开发一种适用于培养肉的蛋白质跟踪器,以方便快捷地追溯和检测肉制品出处及成分等。此外,还需要对采用非农业畜禽物种生产的产品进行监管,如濒危动物、危险动物、宠物、陪伴动物等,对于这种形式的细胞农业生产需要从社会伦理、安全性等方面考虑其许可性及进行必要的保护[46]。

3.2 基于发酵的细胞农业安全监管

有学者认为基于发酵的细胞农业生产的动物性蛋白质与来源于传统畜牧业的蛋白质没有实质性差别。尽管其采用的是基因改造的微生物,但自然界生物体间基因转移现象十分普遍,例如几乎所有品种的甘薯都有来自土壤的微生物基因[47],且细胞培养产品已有多年的安全使用历史,如各种食用真菌、藻类、酶类以及胰岛素等医药产品,所以认为基于发酵的细胞农业生产的动物蛋白是安全的。

基因改造的微生物可能会对环境造成污染及危害,需要对这些微生物进行有效灭活,在运输、操作及卫生等方面应采取特别的安全防范措施,使生产过程中每一步的危险性降到最低[37]。为了规范化管理微生物种类及基因改造类型,生产企业应向相关管理机构提供产品生产安全告知书,告知书内容包括生产所用菌株、生产工艺及流程、培养基成分等。

4 细胞农业发展展望

细胞农业领域目前处于创建初期,为了促进细胞农业的研发,有必要建立学术界和产业界的联盟以确保研究初期就以大规模生产为首要考量,并将生产企业定位为学术研究成果的接受者。此外还要促进生产企业、研究人员、供应商之间的沟通和交流,以减少重复工作并最大限度地利用知识产权许可降低投资风险。

细胞农业需要解决的问题还很多。在培养肉生产方面,期望在分化阶段获得高度结构化的肌肉组织,以期得到特有质地和口感的肉制品,这方面还没有突破性进展;肌肉组织在畜禽体内的生长通常需要血管来提供营养物质,还会受到来自神经和畜禽活动等多种因素的影响;这些都是目前体外培育细胞无法达到的[48-49],这将是今后培养肉研发的重要方向。

与传统畜牧业相比,细胞农业生产培养肉仍有其独特的优势,例如珍稀动物肉制品的生产只需提取少量细胞,从而减少了对珍稀物种的捕杀。利用细胞培养技术还可选择性地生产营养和风味更佳的肉类产品,例如减少肥肉细胞的合成比例、增加瘦肉细胞的合成比例等[50]。

细胞农业也为传统畜牧业提供了新机遇,从收获畜禽体到收获细胞的转变就是从选择并利用高产量杂交品种的基因组和表型转向利用能在低密度、低投入的广泛系统中茁壮成长的更传统的畜禽,这种转变不仅有助于保留传统品种的遗传基因,保护生物多样性,且对环境的影响小,生产利润高。相信在不久的将来细胞农业会成为一个具有巨大商业利益和发展潜力的领域。