热休克蛋白70在急性胰腺炎中的作用及其研究进展

陈燕 杜奕奇

海军军医大学附属长海医院消化内科，上海 200433

【提要】 热休克蛋白70(HSP70)在急性胰腺炎(AP)时通过同时抑制胰蛋白酶原和NF-κB炎症通路的激活来发挥胰腺腺泡细胞的损伤保护作用；HSP70多态性可能与AP患者病情严重程度存在关联，激动过氧化物酶体增殖物激活受体γ可能通过增加腺泡细胞内热休克因子1 /HSP70的激活转录减轻AP严重程度，而激动剂的可选择性可能为临床选择药物救治AP提供安全、有效的可能。

1962年，Ritossa[1]在实验中偶然发现了一个现象，即在较高温度下孵化的果蝇唾液腺中的核酸合成增加。由于该现象发生在细胞暴露于高温下时，他便提出“热休克反应”这个术语。最初发现的热休克蛋白(heat shock protein, HSP)的分子质量都在70×103范围以内，随后发现了与热休克反应相关的多个蛋白，分子质量为(15～110)×103[2-4]。接着在多个亚细胞结构(如线粒体、内质网)中发现了这些HSP，分子质量大的HSP依赖于ATP，在常温或应激温度下表达，具有一系列不同的功能，包括蛋白质折叠和转位、细胞保护及调节凋亡等[5]；分子质量较小的HSP通常有组织特异性，不依赖ATP，具有蛋白质折叠伴侣和抗凋亡功能[6]。HSP家族中最保守和研究最充分的是HSP70超家族。它们依赖ATP，分子质量为(66～78)×103，由一组11个人类基因编码。这些蛋白的水平受热休克因子(heat shock factor，HSF)的转录调控。HSF由HSF1、HSF2、HSF3和HSF4组成，它们的功能相互独立又相互重叠，表达模式具有组织特异性。其中，HSF1是主要的转录调节因子，是HSP基因反式激活和维持耐热性所必需的[7]。HSF1在应激期间被诱导与HSP70的启动子结合以增加其转录。可诱导的HSP70对广泛的刺激敏感，具有良好的治疗潜力。本文就其在急性胰腺炎(AP)中的作用及其研究进展进行综述。

一、AP的酶原激活理论

AP是一种胰腺炎症疾病，最终导致腺泡细胞损伤和死亡。在生理条件下，消化酶由胰腺腺泡细胞合成、储存和分泌，各种保护机制使消化酶在腺泡细胞内免于被激活[8]。然而，在AP期间各种刺激导致消化酶酶原在腺泡细胞内被激活，进而也激活了腺泡细胞死亡和炎症反应途径[9]。研究表明，在AP早期消化酶酶原与溶酶体融合，胰蛋白酶原被激活为胰蛋白酶[10-11]。与此同时，NF-κB依赖的促炎途径被激活，导致炎症细胞因子从腺泡细胞释放，从而放大胰腺局部和全身多器官的损伤[12]。

二、HSP70对胰腺腺泡细胞的保护作用及其机制

HSP70在AP体内外实验中通过以上发病机制发挥其保护作用。这些研究主要通过热应激和非热应激(化学应激源，如β-肾上腺素、亚砷酸钠等非热药物)使胰腺腺泡细胞过表达HSP70实现的。Wagner等[13]发现，当大鼠胰腺的腺泡细胞暴露于热应激时，分子质量为72×103的HSP70表达明显增加；进一步观察到HSP70的过度表达对雨蛙素诱导的AP大鼠器官损伤具有保护作用，且HSP诱导的强度与器官损伤保护程度密切相关。除热应激外，通过非产热方法诱导HSP70过表达的AP模型中也观察到类似的保护作用。β-肾上腺素诱导HSP70过表达可保护小鼠免受雨蛙素诱导的AP胰腺损伤，同时阻止胰蛋白酶原早期激活[14]。亚砷酸钠诱导的HSP70过表达在雨蛙素以及L-精氨酸诱导的AP模型中也提供保护作用，表现为高淀粉酶血症、胰腺水肿和腺泡细胞坏死程度明显减轻；亚砷酸钠预处理不仅能抑制胰蛋白酶原活化，而且在体内和体外都能通过抑制IκBα的降解阻止NF-κB向细胞核的转位[15]。AP的酶原激活机制认为消化酶酶原和溶酶体酶共定位是腺泡内胰蛋白酶激活所必需的。HSP70保护腺泡细胞的机制之一就是干扰酶原颗粒和溶酶体酶的共定位[15]。共定位需要Ca2+内流的初始激增以及随后的持续增加，细胞内Ca2+的螯合可以抑制共定位[16]。对非胰腺细胞的研究发现HSP70可以减弱细胞内Ca2+的增加[17]。除了抑制腺泡细胞内胰蛋白酶原的激活外，HSP70的过表达还通过增加其内源性抑制剂IκBα的水平来降低NF-κB的激活[18]。这些研究证明了HSP70对AP的腺泡细胞损伤具有保护作用，这种保护作用通过同时抑制胰蛋白酶原活化和NF-κB激活实现，且与HSP70的诱导方式无关。

值得一提的是，虽然热应激和化学药物诱导的主要蛋白是HSP70，但这些干预也诱导了其他多种HSPs，因此这些干预所观察到的保护作用是否是HSP70过表达之外的事件引起的，Bhagat等[19]对此进行了研究。他们在体外实验中用反义寡核苷酸和药理两种方法抑制HSP70过表达，发现雨蛙素诱导的AP胰腺损伤中未出现保护作用，说明对雨蛙素诱导的胰腺保护作用是由热应激后的HSP70介导的；然后他们在体内实验中进一步证明了HSP70对胰腺损伤的保护作用，即在热应激前给予抑制HSP70的反义寡核苷酸，此时有其他应激蛋白表达，但HSP70未表达，对雨蛙素诱导的胰腺损伤也失去保护作用，表明这种保护作用是通过过表达的HSP70介导的；但在热应激前给予HSP70的正义寡核苷酸组，热应激对雨蛙素诱导的AP保护作用仍然存在，因为HSP70的过表达未受到影响。该项研究说明，热应激等干预手段对雨蛙素诱导的AP保护作用就是通过诱导HSP70过表达实现的。

三、HSP70多态性预测AP严重程度

人类编码HSP70的主要基因(即HSP70.2)A～G多态性导致诱导性HSP70.2 mRNA表达水平较低(即HSP70.2基因中具有纯合G等位基因)。Balog等[20]发现HSP70多态性与AP严重程度之间存在关联。与轻症AP组(29例)、健康对照组(71例)相比，重症AP组(48例)中有较多的患者具有HSP70.2G等位基因多态性，认为HSP70.2G等位基因的高频率与重症AP的发病风险相关。HSP70水平或多态性未来可能有助于预测AP严重程度和患者预后，基因型评估也可用于指导治疗或识别重症AP的危险人群。而Srivastava等[21]对50例AP患者和50例健康献血员进行前瞻性研究，同样用PstI限制性片段长度多态性方法确定HSP70.2基因的3个等位基因(AA、AG和GG)。结果发现AP患者HSP70.2G等位基因频率明显高于对照组。然而，该多态性与疾病严重程度和并发症均无关。笔者认为上述2项研究病例数量少是主要缺陷，在这方面，中国AP患者例数显示出研究优势，但目前缺乏中国人群相关数据。

四、HSP70在AP研究中的进展

如上所述，HSP70在AP的体内外实验和临床试验中都表现出胰腺保护能力。除此之外，有研究者认为HSP70基因评估也可用于指导治疗或识别重症AP的危险人群。但在临床实际应用方面，HSP70至今没有用作预测指标，目前也缺乏诱导HSP70表达的药物。

HSP70用作临床预测指标困难与其生物学特性有关：即正常情况下HSP70在细胞内(胞核、胞质或亚细胞结构)呈基础表达水平；而在高温、化学药物及各种有害应激状态下，HSP70在细胞内的合成速度显著增加，以提高生物体的抗应激和抗炎能力，在这些体内外实验中，检测HSP70均在细胞水平，且HSP70的过表达对细胞和器官均有保护作用[13-15，22-24]。因此，如果在AP患者血液、体液检测中发现较高表达水平的HSP70，表明病情可能较重。HSP70的保护作用发生在细胞水平，如果细胞损伤甚至坏死，腺泡细胞内的HSP70释放，甚至会和高迁移率族蛋白1(high-mobility-group box 1，HMGB1)一样成为潜在的损伤相关分子(damage associated molecular pattern，DAMP)[18,25-26]。近期有研究报道重症AP患者血清中HMGB1浓度升高，伴有炎症因子的增加，而HSP70浓度降低，因而认为HSP70是保护性蛋白[27]。而我国学者曾发现胰腺腺泡细胞外给予HSP70可在小鼠体内诱导全身炎症反应综合征(SIRS)，其中Toll样受体-4可能参与激发HSP70介导的SIRS[18]。这两项无法相互解释的研究也侧面说明HSP70研究的复杂性，以及其不能作为预测指标的原因。实际上，在细胞水平，HSP70通过多种机制抑制SIRS，其中之一就是减少HMGB1的细胞外分泌和释放[23-24]。

在诱导胰腺腺泡细胞内生成HSP70方面，如前所述亚砷酸钠是灰白色的固体，易溶于水，有剧毒，主要用于农药和杀虫剂。而β肾上腺素主要作用于心脏、血管平滑肌和支气管平滑肌的β受体，小剂量即可兴奋心脏β1受体，产生正性肌力作用，用于心脏骤停、过敏性休克的救治，使用β肾上腺素诱导腺泡细胞HSP70表达时会有较明显的药物不良反应。如前所述，HSF1在应激状态时被诱导与HSP70的启动子结合以增加其转录合成。Bhagat等[19]发现HSF1基因敲除小鼠的HSP70合成减少，小鼠表现为更严重的AP。因此，增加HSF1/HSP70激活转录即能诱导腺泡细胞内HSP70过度表达，而如何激活HSF1目前在AP研究中尚未涉及。在心肌细胞再灌注损伤中，研究者发现使用过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)的天然配体15d-PGJ2可以增加HSF1的DNA结合并上调HSP70的合成，从而发挥保护心肌细胞的作用；而PPARγ的合成激动剂吡格列酮也能减轻心肌细胞损伤和NF-κB炎症通路的激活[28]。有研究发现吡格列酮可以调控AP胰腺腺泡细胞线粒体功能，发挥保护腺泡细胞的作用[29]。笔者推测激动PPARγ可能通过增加腺泡细胞内HSF1/HSP70的激活转录减轻了AP严重程度。另一方面，PPARγ激动剂的可筛选性也为临床选择药物救治AP提供安全、有效的可能。

综上所述，HSP70通过抑制胰蛋白酶原的腺泡内激活和NF-κB炎症通路的激活来介导胰腺腺泡细胞的损伤保护，HSP70的保护作用只发生在细胞水平，如果发生细胞损伤甚至坏死，腺泡细胞内的HSP70则有可能成为潜在的DAMP，实验诱导HSP70过表达的药物具有较高的不良反应，PPARγ激动剂的多品种化提供临床选择合适治疗药物的可能。

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