桑寄生种子的顽拗性生物学特征及保存技术研究

万凌云， 裴河欢2， 付金娥， 潘丽梅， 韦 莹， 何丽丽， 冀晓雯， 韦树根

(1.广西壮族自治区药用植物园， 南宁 530023； 2.钦州市中医药研究所， 广西 钦州 535000)

种子是种质资源保存最为理想的材料，但不同种子类型的贮藏方式不同。基于种子贮藏特性的差异，一般可将种子分为2种类型，即正常性种子(Orthodox seed)和顽拗性种子(Recalcitrant seed)[1]。正常性种子在成熟时经历一个明显的脱水过程，因此正常性种子脱落时含水量较低(可干燥至1%～5%含水量)，在低温状态下可以长期贮藏[2]。顽拗性种子自然风干条件下寿命很短，如黄皮(Clausenalansium)种子采收后寿命只有十多天[3]。这与顽拗性种子在成熟时并不发生脱水过程，脱落时仍保持相对较高的含水量和代谢活性密切相关[4]。顽拗性种子存在一个含水量临界值(Critical moisture content)，即种子低于含水量临界值时，水分胁迫会对种胚造成严重伤害，种子生活力迅速降低[5]，因此，含水量对于顽拗性种子的生活力和贮藏寿命至关重要，顽拗性种子生物学研究中也将种子含水量作为评价种子脱水耐性的重要指标之一[6]。

对于正常性种子而言，因为其含水量低，一般在低温条件下有助于种子贮藏[7]。但顽拗性种子不耐干燥，对脱水敏感，低于脱水临界值时其生活力会迅速下降[8]。大多数顽拗性种子属于温热带植物，适应高温环境，不耐低温，如荔枝(Lichichinensis)、龙眼(Dimocarpuslongyan)、黄皮(Clausenalansium)等[9]。这可能与其成熟时仍保持较高的含水量，且所含水分多为自由水[10]，低温可能会对顽拗性种子造成冷害和冻害[11]。所以顽拗性种子不仅对脱水敏感，也可能表现对低温敏感[12]。

种子顽拗性特征与其独特的发育模式密切相关[13]。顽拗性种子在整个发育过程中一直处于旺盛代谢状态，一旦胚发育成熟即自然进入萌发阶段，因此，顽拗性种子在发育和萌发之间并不存在一个转折点，而是一个自然的过渡[12]。这种自然过渡过程中，ABA水平下降被认为与顽拗性种子顽拗性的关系最为密切[14]。

桑寄生(Taxilluschinensis(DC.) Danser)为桑寄生科钝果寄生属植物。桑寄生是传统的常用大宗中药材，具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎元等功效[15]。种子繁殖是桑寄生繁殖的唯一方式，桑寄生种子成熟过程中不经历脱水过程，成熟脱落时种子含水量高达50.70%以上[16]，对脱水、低温敏感性，具有顽拗性种子生物学特性，严重阻碍了桑寄生种子的贮藏保存[17]。但有关其种子顽拗性及贮藏保存方面仍缺乏系统的研究，本文将探讨桑寄生种子生活力和萌发率间的相关性，桑寄生种子脱水、低温临界值以及植物激素脱落酸(ABA)处理对桑寄生种子保存的作用。初步确定桑寄生种子顽拗性生物学特征并为延长保存时间提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验所需材料采集于广西药用植物园内寄生于桑树(MorusalbaL.)的桑寄生种子，经中国医学科学院药用植物研究所马小军研究员鉴定为桑寄生植物的种子。试验期间，将成熟的桑寄生浆果采集后及时带回实验室，去除果皮和果胶，挑选成熟度、健康大小一致的种子备用。

1.2 方 法

1.2.1桑寄生种子生活力TTC(2，3，5-三苯基氯化四氮唑)测定法的条件筛选

采用L9(33)正交试验设计法考察TTC浓度、染色温度(培养箱的温度)和染色时间3种因素对桑寄生种子生活力测定结果的影响，各因素水平具体见表1。

表1 TTC测定因素和测定水平

水平因素TTC浓度/%时间/h温度/℃10.442520.883031.21235

TTC测定具体操作参考雷慧霞等[18]方法。每组试验取桑寄生种子100粒，记录染色种子数，以染色种子数占总种子数的百分比表示种子生活力。最终确定桑寄生种子生活力TTC测定法各因素的最适水平组合，并进行种子生活力测定验证。

1.2.2常温存放时桑寄生种子生活力和种子萌发率变化

将桑寄生种子在室内常温(25 ℃)环境下自然存放。每天取桑寄生种子600粒，平均分成2组分别进行生活力和萌发率测定，每100粒种子作为1次重复，重复3次。分别统计染色种子数和萌发种子数，以其占总种子数的百分比分别代表种子生活力和种子萌发率。

1.2.3桑寄生种子顽拗性测定

脱水敏感性试验：每100粒新鲜干净的桑寄生种子为一份，然后放置于装有硅胶的密闭干燥容器中，每隔4 h取6份种子分为2组，每组3份作为3次重复，分别用TTC法测定种子生活力和烘干干燥法测定种子含水量。

低温敏感性试验：将新鲜干净的桑寄生种子分别放到2 ℃，0 ℃，-2 ℃，-20 ℃的冰箱内保存。前5 d，每处理每天取出300粒种子用于种子生活力测定，每100粒种子作为1次重复，重复3次；5 d后，每隔5 d测定一次种子生活力；30 d后，间隔15 d测定1次种子生活力。

1.2.4桑寄生种子保存方法

种子保存温度筛选：将新鲜干净的桑寄生种子分别存放于2 ℃，4 ℃，6 ℃，25 ℃ 4个温度条件下。方法同1.2.3中低温敏感性试验。

ABA浸泡：将新鲜干净的桑寄生种子在2 mg·L-1的ABA溶液中浸泡30 min，然后存放于上述筛选的最佳保存温度中进行保存。种子生活力测定时间与上述种子保存温度筛选试验一致。

1.2.5数据统计分析

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行One-way ANOVA方差分析、Duncan多重比较和Pearson相关性分析，采用Origin 2018软件作图。

2 结 果

2.1 桑寄生种子生活力与种子萌发率的关系

2.1.1桑寄生种子生活力TTC法测定条件筛选

种子生活力反映了种子的发芽潜在能力和种胚所具有的生命力，是判断种子质量的重要指标。TTC染色法是测定种子生活力的常用方法。

表2 TTC法测定桑寄生种子的生活力

序号ATTC浓度/%B染色温度/℃C染色时间/h生活力/%10.425417.0020.430868.0030.4351263.0040.825882.0050.8301288.0060.835466.0071.2251272.0081.230453.0091.235875.00K149.3357.0045.33—K278.6769.6775.00—K366.6768.0074.33—分析较优水平A2B2C2极差分析29.3312.6729.67主次因素C>A>B

注：K 1，K 2，K 3代表每个处理的3个水平数据的综合平均。

从表2可知，TTC浓度为0.4%、0.8%和1.2%时种子生活力综合平均值分别为49.33%、78.67%和66.67%，可见TTC浓度为0.8%时桑寄生种子生活力最高。而染色温度以30 ℃种子生活力最高，染色时间以8 h种子生活力最高。而通过极差分析表明，影响桑寄生种子生活力测定的主要因素染色时间>TTC浓度>染色温度。所以TTC法测定桑寄生适宜条件是染色时间8 h，TTC浓度0.8%，染色温度30 ℃。

因为在上述正交试验中未出现过染色时间8 h，TTC浓度0.8%，染色温度30 ℃的试验组，为此设置了对TTC测定筛选条件的验证试验。从表3可知，筛选的TTC法测定条件下的桑寄生种子生活力平均值为92.75%，高于正交试验中的任意试验组，且标准偏差仅为1.50，表明筛选的TTC法测定条件稳定。

表3 桑寄生种子生活力TTC法测定适宜条件验证

组数试验种子数染色种子数生活力/%11009292.0021009494.0031009494.0041009191.00平均92.75±1.50

2.1.2常温存放下桑寄生种子生活力和萌发率变化

将桑寄生种子采摘后在室内常温(25 ℃)存放。从图1可知，采摘当天(0 d)桑寄生种子生活力和萌发率最高，分别为95.00%和82.00%，存放第1天桑寄生种子生活力和萌发率略有下降，分别为94.00%和79.00%。但存放第2天开始，桑寄生种子生活力和萌发率开始显著下降，存放第3天桑寄生种子生活力和萌发率已分别下降至52.00%和39.00%。存放到第7天时，桑寄生种子生活力仅为6.00%，基本失去萌发能力。可见桑寄生种子生活力一直高于萌发率，但生活力和萌发率随存放时间的变化趋势十分相似。

图1 常温存放下桑寄生种子生活力和萌发率变化

将桑寄生种子生活力与其对应的种子萌发率进行相关性分析。从图2可知，二者呈极显著的线性相关(R2=0.990,p<0.001)，以桑寄生种子生活力为X，以桑寄生种子萌发率为Y，进行线性方程拟合得到Y=0.936X-8.956，因此，可依据此方程中的桑寄生种子生活力推算出桑寄生种子的理论萌发率。

2.2 桑寄生种子的顽拗性

2.2.1桑寄生种子的脱水敏感性

从图3可知，脱水处理4 h和8 h脱水速率较快，脱水4 h的脱水速率分别为9.15%和3.13%，变化达到了显著水平。8 h之后脱水速率减缓，每脱水4 h桑寄生种子脱水速率约2.00%，每脱水8 h桑寄生种子脱水率变化才达到显著水平。随着桑寄生种子含水量的下降，其种子生活力也相应下降。脱水4 h，桑寄生种子含水量为41.55%，种子生活力受到的影响较小；脱水8 h，桑寄生种子生活力显著下降；脱水16 h，桑寄生种子含水量为35.17%，种子生活力迅速下降，为66.00%；脱水28 h，桑寄生种子含水量已降至30.00%，为29.17%，种子生活力呈线性迅速下降，之后每脱水4 h桑寄生种子生活力变化均达到显著水平。当桑寄生种子含水量在25.00%以下时，种子生活力很低，根据上述桑寄生种子生活力与种子萌发率线性方程可知，当桑寄生种子生活力低于10%时，种子萌发率为0.00%，因此，脱水40 h，桑寄生种子含水量仅为23.47%，种子生活力仅为9.00%，此时桑寄生种子基本无萌发能力。

图2 桑寄生种子生活力与种子萌发率的相关性

图3 脱水处理对桑寄生种子生活力的影响

2.2.2桑寄生种子的低温敏感性

从表4可知，桑寄生种子在-20 ℃、-2 ℃的温度下存放1 d即完全丧失生活力；而在0 ℃下存放1 d，生活力迅速下降到12%，存放4 d完全丧失了生活力。桑寄生种子在2 ℃温度下虽随着存放时间增加，生活力逐渐下降，但其在存放前5 d生活力下降幅度不大，存放第10天时才开始显著地快速下降，并直到存放75 d才完全丧失生活力。

表4 低温处理下的桑寄生种子生活力

存放时间/d温度/℃20-2-20182.00a12.00a——284.00a6.00b——378.00ab2.00c——478.00ab———575.00b———1067.00c———1554.00d———2038.00e———2532.00f———3025.00g———4511.00h———605.00i———75————

2.3 桑寄生种子的保存

2.3.1保存温度对桑寄生种子生活力的影响

从图4可知，不同温度条件下桑寄生种子生活力随存放时间的变化是不同的。在25 ℃条件下存放，桑寄生种子生活力每一天都在显著地下降，存放第5天时，种子生活力降至26%。在2 ℃、4 ℃和6 ℃条件下，存放的前5 d的桑寄生种子生活力下降均比较缓慢，3种温度条件下桑寄生种子生活力也较为相近。第10天之后，桑寄生种子生活力在3种温度条件下开始迅速下降，但下降速率不太相同，桑寄生种子生活力在4 ℃条件下一直明显地高于2 ℃和6 ℃，且保存90 d后完全丧失生活力。而在2 ℃和6 ℃条件下，桑寄生种子分别仅保存到60 d和45 d就完全丧失生活力。

图4 不同温度条件下桑寄生种子生活力随存放时间的变化

2.3.2ABA对桑寄生种子生活力的影响

从图5可知，对照组的桑寄生种子生活力存放5 d后开始下降，而ABA浸泡组则10 d后开始下降，ABA浸泡明显延缓了桑寄生种子生活力下降时间。存放第5天开始，ABA浸泡组的桑寄生种子生活力在每个存放时间点均高于对照组，且ABA浸泡组的桑寄生种子至完全丧失生活力保存时间最终为135 d，多于对照组的90 d保存时间。

图5 ABA浸泡后桑寄生种子生活力随存放时间的变化

3 讨 论

种子质量是药材产量和品质的重要基础和前提，而种子萌发率是检测种子质量的重要指标之一[19]。但有些植物物种的种子萌发时间不一致导致整个萌发过程较长，如桑寄生种子在25 ℃条件下萌发势最高到达35 d[20]。因此，应用种子萌发率检测桑寄生质量种子是一个长时间的过程。而TTC法则是一种能快速判断种子潜在发芽能力的有效方法，现已开始广泛应用于药用植物种子质量检测，如北细辛[21]、厚朴[22]、肉苁蓉[23]等，但不同植物物种TTC法最适宜的测定条件有所差异。本实验通过正交试验设计法探讨了TTC浓度、染色时间和染色温度对桑寄生种子生活力测定的影响，最后确定了TTC法测定桑寄生种子生活力的最佳测定条件组合。种子生活力不一定能真实地反映种子萌发能力，但对车前子[24]、红豆[25]、白术[26]等药用植物的研究表明，种子生活力与种子萌发率存在一定的相关性。因此，本文将桑寄生种子生活力和萌发率进行了相关性分析，结果表明二者呈显著线性正相关关系，并得到了线性方程(图2)。以本线性方程可应用TTC法快速、准确、简便地测定桑寄生种子生活力数值，预测桑寄生种子萌发率，从而为桑寄生种子质量检测提供了快速、准确、简便和适用的方法。

前人对桑寄生种子的研究表明，桑寄生种子对脱水和低温敏感，具有顽拗性种子的生物特性[17]。但不同植物物种对脱水和低温耐性是不同的，如红毛丹种子(Nepheliumlappaceum)脱水临界值约为20.00%，木菠萝种子(Artocarpusheterophyllus)约为30%，榴莲种子(Duriozibethinus)约为45.00%，而海橄雌种子(Avicenniamarina)约为52.00%，为此根据忍耐脱水能力的不同，又将顽拗型种子分为低度、中等和高度3类[2]；而热带种子较之温带种子更易受低温损害[27-28]。对桑寄生种子的脱水和低温的临界值是多少还尚不清晰。本实验在不同脱水和低温条件下测定桑寄生种子生活力，不仅揭示了桑寄生种子生活力随不同脱水程度和低温条件的变化规律，还确定了桑寄生种子脱水临界值约为30.00%，而低温临界值约为0 ℃。

适合正常种子贮藏的低温、低含水量和密闭条件往往并不适合顽拗性种子[29]，甚至会加快种子的死亡[30]。顽拗性种子保存的温度既要低至足以抑制或减慢萌发而又要高至足以阻止低温的伤害[31]，因此，顽拗性种子对脱水和低温敏感性也决定了其保存技术是顽拗性种子研究中的热点和难点。本实验通过对比不同温度条件下桑寄生种子生活力随保存时间的变化，虽然所有的温度条件下桑寄生种子生活力都随保存时间呈下降趋势，在4 ℃时桑寄生种子生活力下降最为缓慢，直到90 d种子才完全丧失生活力。这也表明适度的温度选择也可以延缓顽拗性种子的失活速度[32]。另一方面，脱落酸ABA在种子发育与萌发过程具有重要作用[33]，其含量的下降与顽拗性种子的顽拗性也是密切相关[14]。因此，本实验通过利用外源植物激素ABA浸泡桑寄生种子，然后在4 ℃条件下保存，结果表明，ABA浸泡后的前10 d桑寄生种子生活力基本没有下降，较之对照组延长了5 d，且生活力下降速率进一步的延缓。前人对顽拗性种子发育和萌发过程中ABA的作用研究表明，ABA一方面能抑制种子代谢作用，阻止胚萌发而促进发育，如抑制α-淀粉酶活性[34]，另一方面能在转录水平上促进贮藏蛋白合成和积累[33]。此外，ABA还是种胚发育后期亲水性蛋白(LEA)基因表达的信使，诱导LEA蛋白产生和积累，其与大分子结构结合对种子脱水伤害起保护作用[35-36]。因此，ABA在顽拗性种子生活力保持方面具有十分重要的作用。初步确定延缓桑寄生种子失活的办法：将用无菌水处理过的新鲜种子浸泡到2 mg·L-1的ABA溶液中30 min，取出沥干表面水分，摊开放置于铺有2层消毒滤纸的培养皿内，然后用封口袋包装好置于4 ℃的冰箱保存。

综上所述，确定了桑寄生种子生活力TTC法测定的最佳条件组合；拟合了桑寄生种子生活力与种子萌发率的线性方程，为桑寄生种子质量检测提供了快速、准确、简便和适用的方法；系统地描述了桑寄生种子的顽拗性生物学特性；初步探索了桑寄生种子保存的办法。本研究结果为进一步探讨桑寄生对脱水和低温敏感机理以及超低温长期保存的研究提供科学参考。