玉米自交系发芽期至苗期耐冷性鉴定

(辽宁省农业科学院玉米研究所， 沈阳 110161)

玉米是典型的喜温植物，生长发育需要适宜的温度，当遭遇低温时很容易造成冷害胁迫[1-2]。尤其在生长发育的早期阶段，玉米对低温十分敏感，若此时发生冷害胁迫，会严重影响种子萌发、抑制幼苗生长发育、降低幼苗活力甚至导致死亡[3-5]。东北地区是我国的主要玉米生产地，然而该地区经常发生早春低温冷害，限制了玉米种子的萌发和幼苗的生长发育，严重时会导致玉米生长后期籽粒品质和产量的下降，甚至大面积减产[6-7]。在东北地区低温冷害已经成为影响玉米早期生长发育的主要非生物逆境胁迫因素[8-10]。因此，鉴定和筛选玉米耐冷种质资源进而开展耐冷新品种选育是解决这一问题的重要途径。

目前，玉米耐冷性鉴定方法主要包括田间自然鉴定和室内鉴定。田间自然鉴定方法主要是通过调整播种时期，利用田间自然低温条件直接从形态学指标的变化来评价不同品种间耐冷性的差异[11]。田间鉴定比较直观，但是鉴定成本较高，且鉴定结果受气候条件影响较大，因此一般需要辅助室内鉴定，从而获得比较稳定和准确的试验结果。室内鉴定方法主要通过控制人工气候培养箱或人工气候室等仪器的低温环境，进而评价试验材料的耐冷性。Strigens等[12]通过室内鉴定，分析了375份玉米自交系光合效率、叶绿素含量、干物质积累量和植株相对生长速率等指标，筛选了玉米耐冷自交系；Huang等[13]利用同样方法评价了125份玉米自交系的耐冷性；Brandolini等[14]研究了玉米萌发阶段的耐冷性，并筛选出安第斯地区优良的玉米耐冷品种；张晓聪[15]等研究了玉米芽期的耐冷性，并筛选了玉米芽期耐冷性鉴定指标。田间鉴定结合室内鉴定法是玉米早期耐冷性鉴定和种质资源筛选以及进行耐冷遗传机理研究比较常用的方法。

低温胁迫对植物的伤害主要表现为膜损伤而引起的内部代谢紊乱[16-17]。丙二醛(MDA)为膜脂过氧化过程中活性氧攻击细胞膜上的膜脂而产生，MDA含量是逆境生理研究中的一个标志膜脂过氧化程度的重要生理指标。而植物体内重要的氧化酶类包括超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)能够通过一系列化学反应清除氧自由基，降低低温胁迫造成的伤害[18]。因此，除了形态指标外，生理指标MDA、SOD和POD含量也可作为玉米耐冷性鉴定的重要指标。本研究主要通过田间自然鉴定和室内鉴定相结合的方法，对20个东北地区生产上主要利用的玉米骨干自交系种子发芽期至苗期进行耐冷性鉴定，确定有效的鉴定指标并筛选玉米耐冷自交系，为建立耐冷玉米种质资源鉴定体系奠定基础，并为玉米育种生产实践提供重要基础材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为20个东北地区生产上主要利用的玉米自交系，包括：中106、辽2386、辽68、C 8605-2、辽6027、辽1412、沈137、黄早4、辽2309、辽88、K 12、铁9010、辽6082、辽7980、辽2345、郑58、辽6049、辽511、S 121、PH 6 WC，以上自交系均为本实验室当年繁育材料。

1.2 试验方法

1.2.1田间自然低温种子萌发试验

试验地点设置在辽宁省农业科学院院内试验基地，试验地地势平坦，土层均匀。试验分2期进行播种，第1期利用早春低温天气提前播种，时间为2017年4月7日(比正常播种提前18 d)，第2期为适期播种，时间为2017年4月25日(对照)。试验采用随机区组设计，3个区组，20个小区，3次重复。行长2.5 m，行距20 cm，每行30粒种子，均匀单粒播种。待50%以上种子出土高度达到2～3 cm时统计田间出苗率。

1.2.2低温处理种子萌发试验

每个自交系挑选健康饱满的种子100粒，先用0.5%次氯酸钠溶液消毒5 min，然后用蒸馏水冲洗3次，温水浸种24 h后分别转入垫有湿润滤纸的培养皿进行发芽试验。试验采用人工气候培养箱(三洋MLR-351 H)模拟低温，根据前人研究经验，培养环境设置为10 ℃恒温(对照为25 ℃恒温)[19]，每天光照12 h。培养15 d统计种子胚根突破种皮2 mm以上的种子数量，并计算萌发率。设置4次生物学重复。

萌发率(%)=(发芽试验末期规定日期内正常的萌发种子数/供试种子总数)×100%。

1.2.3玉米芽期低温试验

每个自交系挑选健康饱满的50粒种子在25 ℃恒温箱中发芽，待芽长0.5 cm左右时，将幼芽放入2 ℃低温培养箱中(每天光照12 h)低温胁迫6 d，然后在25 ℃培养箱中(每天光照12 h)恢复培养6 d[19]。按照幼芽形态和存活率将玉米自交系耐冷性分为5级，处理结束后统计各个自交系幼芽存活率和耐冷等级。设置4次生物学重复。

1.2.4玉米苗期低温试验

每个自交系挑选健康饱满的50粒种子，按照GB/T 3543.4-1995标准发芽试验规程[20]，采用沙盘培养法在25 ℃的恒温培养箱里进行发芽试验。发芽7 d后，将处理组幼苗置于3 °C低温培养箱中(每天光照12 h)进行低温胁迫5 d，然后在25 ℃培养箱中(每天光照12 h)恢复培养3 d。对照组一直放置在25 ℃光照培养箱中正常生长[19]。设置4次生物学重复。处理结束后将幼苗叶片取下，迅速放入液氮中，测定叶片中MDA含量和SOD、POD活性。MDA含量测定采用硫代巴比妥(TBA)显色反应法，SOD活性测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法，POD活性测定采用愈创木酚法，具体参照张蜀秋[21]的方法。

表1 田间自然低温和室内低温对种子萌发的影响方差分析

指标 变异来源平方和SS自由度df均方MSF值田间适时播种出苗率自交系3325.60019175.03212.776∗∗误差548.0004013.700田间早春低温播种出苗率自交系20883.519191099.13316.129∗∗误差2725.9264068.148田间早春低温播种相对出苗率自交系25649.866191349.99314.567∗∗误差3706.9214092.673室内25℃萌发率自交系2615.65019137.6668.352∗∗误差659.3334016.483室内10℃萌发率自交系32707.066191721.42543.311∗∗误差1589.8214039.746室内10℃相对萌发率自交系39664.023192087.58047.537∗∗误差1756.5914043.915

注：*、**分别代表在0.05、0.01水平差异显著。下同。

1.3 数据处理与分析

采用Excel 2010软件进行数据统计，应用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析和多重比较，用皮尔逊相关系数进行相关性分析，用R Studio欧式聚类法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 玉米自交系萌发期耐冷性鉴定分析

对出苗率和萌发率各指标进行方差分析结果显示，在田间自然条件和室内培养条件下，不同自交系各指标均达到极显著水平(表1)。田间适时播种出苗率的变异幅度为75.33%～98.67%，而早春低温播种相对出苗率的变异幅度显著变大，为17.18%～91.70%；室内25 ℃条件各自交系种子萌发率的变异幅度为78.67%～98.67%，而10 ℃条件相对萌发率变异幅度也显著变大，为0.00%～79.00%。多重比较结果显示，早春低温播种相对出苗率较高的自交系为辽1412、辽7980和辽2386，出苗率分别为(91.70±4.39)%、(88.58±18.31)%和(86.48±4.79)%，其次是辽6049、辽2345和郑58；室内10 ℃低温条件下相对萌发率较高的自交系为辽1412、辽2386和辽6049，萌发率分别为(79.00±9.64)%、(74.19±6.45)%和(74.19±6.45)%，其次是辽511、中106和辽2309(表2)。说明不同自交系对低温敏感性不同，低温发芽率和萌发率存在很大的遗传变异。

2.2 玉米自交系芽期耐冷性鉴定分析

对不同自交系芽期进行低温处理，大部分植株表现出叶片萎蔫、黄化、植株矮小等现象，且部分植株死亡。以低温处理后玉米幼芽的形态作为评价指标，分1～5级评价，并以此将不同的自交系划分出不同的耐冷等级。耐冷等级较高的自交系为S 121和PH 6 WC，其次为中106、辽2386、黄早4和辽88，耐冷等级较低的自交系为辽68、辽1412、辽2309、K 12、辽6082、辽511和辽6049(表3)。低温处理后植株存活率较高的自交系为S 121、辽7980、C 8605-2和中106，存活率分别为(91.67±8.33)%、(88.92±1.98)%、(86.34±0.62)%和(80.89±6.61)%，其次是黄早4和辽2386(图1)。综合芽期存活率和表型鉴定，芽期耐冷性较高的自交系为S 121、中106、黄早4和辽2386，较低的自交系为辽68、辽1412、辽2309、K 12、辽6082、辽511和辽6049。

图1 玉米自交系芽期低温处理后植株存活率

2.3 玉米自交系苗期耐冷性鉴定分析

低温胁迫对玉米外观形态的影响源于幼苗体内生理生化反应发生的变化。一般认为，植物内部的POD、SOD活性与植物对低温逆境的适应性呈正相关，而MDA含量与植物对低温逆境的适应性呈负相关[18]。对玉米自交系苗期低温处理前后的叶片进行MDA含量和SOD、POD活性测定。结果显示，低温胁迫后大部分自交系MDA、SOD和POD含量显著升高。其中SOD和POD活性增幅较大、MDA含量增幅较小的自交系表现为耐冷性较强，包括辽2386、PH 6 WC和中106，而SOD和POD活性增幅较小、MDA含量增幅较大的自交系表现为冷敏感性，包括辽6082、辽2309、K 12(表4)。

表2 田间自然低温和室内低温条件下玉米自交系出苗率的变化

自交系 田 间 室 内 适时播种出苗率/%早春低温播种出苗率/%早春低温播种相对出苗率/%25℃萌发率/%10℃萌发率/%10℃相对萌发率/%辽141294.67±6.11abc86.67±3.33a91.70±4.39a90.00±7.21cdef71.48±13.85a79.00±9.64a辽798077.33±7.02h67.78±10.18bc88.58±18.31a79.67±3.51g24.13±6.25cde30.43±8.70cd辽238687.33±1.15def75.56±5.09ab86.48±4.79a90.33±4.51bcde66.83±2.50a74.19±6.45a辽604989.33±1.15cde61.11±10.18bcde68.32±10.63b92.00±2.00abcd68.22±5.40a74.19±6.45a辽234598.67±1.15a66.67±10.00bcd67.51±9.43b94.67±4.62abc14.65±6.51efgh15.31±6.12efg郑5882.00±2.00fgh54.44±15.14cdef66.16±17.62b82.67±3.06fg17.87±4.32def21.52±4.38de辽8896.67±1.15ab61.11±3.85bcde63.21±3.68bc97.33±3.06abc16.91±4.32efg17.48±5.04efPH6WC92.67±2.52abcd56.67±8.82cdef61.35±11.27bcd93.33±1.15abcd5.94±7.85ghi6.32±8.36fgh辽6894.00±2.00abcd55.56±6.94cdef59.20±8.44bcde97.33±3.06abc0.00±0.00i0.00±0.00h辽51185.33±6.11efg50.00±6.67efg58.56±6.06bcde86.00±4.00defg42.86±8.58b50.00±10.71b中10694.67±1.53abc51.11±9.62def53.90±9.43bcde95.33±1.15abc40.86±5.90b42.86±6.12b辽608296.00±2.00abc44.44±8.39fgh46.26±8.46cdef98.00±2.00ab0.00±0.00i0.00±0.00h辽230996.67±3.06ab44.44±10.72fgh45.80±9.66cdef97.67±2.52abc41.25±11.35b42.31±12.01bC8605-280.00±8.72gh35.56±12.62ghi44.46±14.33defg83.33±6.43efg33.15±8.47bc39.71±8.82bc沈13798.67±2.31a42.22±5.09fgh42.82±5.39efg98.67±1.15a0.92±1.60i0.94±1.63hK1294.67±1.15abc33.33±6.67hij35.21±7.11fgh96.00±3.46abc28.74±2.06cd30.00±3.00cdS12175.33±4.16h23.33±3.33ijk31.15±5.62fghi78.67±4.16g3.38±3.27hi4.41±4.41gh铁901094.00±2.00abcd25.56±1.92ijk27.20±2.14ghi96.00±4.00abc8.57±7.61fghi9.09±8.02fgh辽602777.33±3.06h18.89±8.39jk24.62±11.61hi83.33±7.57efg0.00±0.00i0.00±0.00h黄早490.67±1.15bcde15.56±1.92k17.17±2.32i83.33±4.16efg4.13±1.63hi5.00±2.17gh变异幅度75.33～98.6715.56～86.6717.18～91.7078.67～98.670.00～71.480.00～79.00

注：同列不同小写字母表示0.05 水平差异显著(LSD)。下同。

表3 玉米自交系芽期冷害等级划分及表型

耐冷等级自交系表型Ⅰ级S121、PH6WC植株健壮,叶片生长正常,绿色有光泽,大部分植株基本没有受到影响。Ⅱ级中106、辽2386、黄早4、辽88植株稍有萎蔫,受害叶边缘萎缩呈灰黑色或者叶片卷缩呈针状。Ⅲ级C8605-2、辽6027、沈137、郑58有约半数叶片受害,中下部叶片下垂皱缩,部分植株生长矮小。Ⅳ级铁9010、辽7980、辽2345大部分叶片受害, 受害叶局部或大部分失水萎缩或叶片卷缩呈针状,大部分植株生长矮小。Ⅴ级辽68、辽1412、辽2309、K12、辽6082、辽511、辽6049全部叶片均受冻害,叶片失水褐化,皱缩下垂,大部分死亡。

2.4 玉米自交系耐冷性鉴定指标的相关性分析

对不同自交系低温出苗率、芽期存活率和苗期等耐冷性状进行相关分析结果显示，田间自然条件下的早春低温播种相对出苗率和室内10 ℃相对萌发率相关性达到极显著水平，相关系数为0.619，而不同生育时期耐冷相关性状相关性均不显著(表5)，推测原因可能是因为玉米不同生育时期的耐冷机理不同。

2.5 玉米自交系耐冷性的聚类分析

为了综合分析评定玉米自交系在生育期前期的耐冷性，以田间相对出苗率、室内萌发率、芽期存活率以及苗期生理指标的相对值为变量进行聚类分析，20个自交系可分为3类(图2)。类Ⅰ为玉米综合耐冷性较强的自交系辽1412、辽6049、辽7980、辽2386和中106，其田间条件下早春低温播种相对出苗率、室内低温萌发率和芽期低温存活率高，平均分别为77.79%、60.14%和52.02%，苗期低温处理后SOD和POD增幅大。类Ⅱ为耐冷性中等的自交系PH 6 WC、辽6027、C 8605-2、辽88、辽68、沈137、铁9010、辽2345和郑58，其田间条件下早春低温播种相对出苗率和芽期低温存活率较高。类Ⅲ为耐冷性弱的自交系S 121、黄早4、K 12、辽6082、辽2309和辽511，其田间条件下早春低温播种相对出苗率、室内低温萌发率和芽期低温存活率较低，平均分别为39.03%、21.95%和32.35%，苗期低温处理后MDA含量增幅较大(表6)。

图2 玉米自交系聚类分析

表4 玉米苗期低温条件下MDA含量以及SOD和POD活性的变化

自交系 MDA含量/[U·(g·min)-1](FW) SOD活性/[U·(g·min)-1](FW) POD活性/[U·(g·min)-1](FW) ck低温胁迫增加幅度/%ck低温胁迫增加幅度/%ck低温胁迫增加幅度/%辽14123.77±1.033.47±0.26-8.0314.91±5.7925.89±8.4473.62767.58±106.961126.04±176.0746.70辽79802.28±0.187.44±1.82226.1318.68±2.7019.35±1.693.60631.47±62.731433.56±32.29127.02辽23866.74±1.5415.05±2.76123.2210.49±3.5125.89±1.47146.89613.36±78.961624.07±56.74164.78辽60494.90±2.5010.80±2.95120.408.32±6.8113.52±1.4662.35693.18±179.851539.13±32.52122.04辽23453.36±1.124.26±0.8126.9617.13±2.9828.59±8.3566.94656.37±11.93923.67±221.8140.72郑583.49±0.069.44±2.11170.5310.41±3.5020.45±7.3196.35700.72±79.01932.63±56.1533.10辽8817.28±2.657.81±0.45-54.7717.77±3.0112.19±8.52-31.38539.57±11.33791.26±1.7146.65PH6WC3.83±0.6610.42±0.52172.3216.56±7.1126.26±4.8358.52381.00±73.402008.61±297.04427.19辽689.24±3.544.16±0.70-54.997.71±2.6112.36±1.3660.28752.29±73.061047.87±101.9039.29辽5111.67±0.0510.00±2.33499.0215.73±4.0623.02±0.6646.33430.33±89.821230.76±194.26186.01中1063.71±0.315.91±0.6359.5410.45±1.3925.00±12.40139.20425.47±61.191061.67±348.63149.53辽60822.51±0.9613.31±5.64429.8215.40±6.3626.94±0.6174.88744.54±240.341110.65±22.4849.17辽23093.76±0.0620.65±12.09449.7721.77±0.2724.54±10.4212.69521.53±140.24728.01±91.2339.59C8605-22.59±0.145.25±0.88102.8923.18±5.5120.97±6.81-9.52487.26±112.76895.24±120.1683.73沈1373.29±2.044.93±0.2550.0015.98±6.5528.05±1.7275.53687.25±160.381021.88±121.8948.69K121.84±0.046.43±0.10249.238.73±2.1216.71±0.1091.51652.60±83.08796.46±26.2922.05S1211.98±1.137.03±0.89255.5313.07±1.8218.85±9.2544.23413.48±34.541198.98±17.14189.97铁90105.72±1.3512.85±5.80124.4810.01±0.5119.59±4.3195.63536.98±190.85769.50±97.5043.30辽60272.46±0.354.55±1.5784.827.61±5.993.13±1.20-58.80495.38±162.54957.02±23.3493.19黄早41.39±0.5310.16±3.26632.6614.00±1.6113.92±6.23-0.53470.28±44.731103.60±267.37134.67

表5 玉米自交系各性状间的相关系数

性状早春低温播种相对出苗率室内10℃相对萌发率芽期存活率MDA增加幅度SOD增加幅度POD增加幅度早春低温播种相对出苗率10.619∗∗-0.122-0.3900.2950.084室内10℃相对萌发率1-0.200-0.0760.3090.008芽期存活率1.000-0.068-0.1200.407MDA增加幅度1.0000.1380.182SOD增加幅度1.0000.038POD增加幅度1.000

表6 3类不同耐冷性玉米自交系各性状平均相对值

类群早春低温播种相对出苗率/%室内10℃相对萌发率/%芽期存活率/%MDA增加幅度SOD增加幅度POD增加幅度Ⅰ77.7960.1452.02104.2585.13122.01Ⅱ50.7212.2653.9169.1439.2895.10Ⅲ39.0321.9532.35419.3444.85103.58

3 讨 论

玉米耐冷特性是非常复杂的由多基因控制的数量性状，是遗传因素与环境因素长期互作的结果[22-23]，一般采用单个的耐冷指标很难对玉米品种的耐冷性做出准确的评价，同时由于不同血缘玉米品种遗传背景差异较大，因此，常采用多个性状指标或者低温与常温下的相对值作为评价指标综合评价玉米耐冷性[24]。张晓聪等[15]以8个玉米自交系为材料，采用6个相对性状对自交系芽期的耐冷特性进行鉴定，并筛选出玉米较好的芽期鉴定指标。扈光辉等[25]以玉米出苗率和出苗指数为鉴定指标，对60分玉米自交系进行鉴定筛选，筛选出5份耐低温种质。本试验综合采用了玉米出苗期的早春低温播种相对出苗率和室内10 ℃相对萌发率、芽期存活率和苗期生理指标的增加幅度共计6个耐冷指标作为评价标准，并通过聚类分析等方法综合评价20个玉米自交系的耐冷性，分别筛选出耐冷性较强、中等和较弱的自交系，为玉米耐冷种质资源筛选和生产实践提供了重要基础材料。

玉米的耐冷性鉴定研究方法中主要有田间鉴定法和室内鉴定法，由于田间鉴定法受气候影响较大，因此一般采用田间鉴定和室内鉴定相结合的方法[26-27]。在本试验中，以田间早春低温播种相对出苗率和室内10 ℃低温条件下相对萌发率作为出苗期耐冷筛选的重要指标。多重比较结果显示，不同自交系低温发芽率和萌发率存在很大的遗传变异，虽然田间自然条件下的早春低温播种相对出苗率和室内10 ℃相对萌发率相关性达到极显著水平，但是同一自交系这2个指标上还是存在一定的差异，例如辽7980田间相对出苗率为(88.58±18.31)%，而室内相对萌发率为(30.43±8.70)%，分析原因可能是由于室外播种受气候条件影响导致。Hope等研究显示，在10 ℃低温条件下，玉米自交系经常在出苗前出现死亡现象[28]；而本试验采用10 ℃作为室内低温筛选条件，并筛选出了耐冷的自交系，结论与Hope等研究结果略有差异，可能是由于本试验所选用的20个自交系均为东北地区筛选的骨干自交系，处于高纬度地区，所以耐冷性相对较强。

目前，对冷害机制研究较多，黄伟超等研究表明，植物细胞膜结构的稳定性以及抗氧化保护酶系统与植物耐冷性具有密切的关系[18]。本研究选用的玉米苗期鉴定指标均为细胞膜系统稳定性以及与抗氧化酶相关的生理指标。MDA为膜脂过氧化过程中，活性氧攻击细胞膜上的膜脂而产生。MDA含量越高，说明植物受冷胁迫影响越大。而POD和SOD能够通过化学反应清除植物体内的氧自由基，保护植物细胞。曹梦可研究表明，玉米耐冷品种受低温影响各指标的变化幅度明显小于低温敏感品种，且MDA含量下降，MDA含量与保护酶活性基本呈负相关[29]。伊凡研究也表明，植物细胞内的抗氧化酶活性与玉米苗期耐冷性具有显著的相关性[30]。本试验对玉米自交系苗期低温处理前后的叶片进行MDA含量和SOD、POD活性测定，其中大部分耐冷性较强的自交系表现为SOD和POD活性增幅较大、MDA含量增幅较小，冷敏感自交系表现相反，这与前人研究结果相一致。

玉米不同生育时期耐冷的遗传机制尚未得到明确的阐释。部分研究认为，玉米出苗期、芽期和苗期可能受不同的遗传因素调控，因此耐冷性可能会有所不同。本试验对不同自交系低温出苗率、芽期存活率和苗期等耐冷性状进行相关分析结果显示，不同生育时期耐冷相关性状相关性均不显著，且聚类分析结果中类Ⅰ自交系早春低温播种相对出苗率较高，而苗期叶片中抗氧化酶增加幅度却相对较低，说明玉米不同生育时期的耐冷性可能有不同的调控路径参与，进而导致耐冷机理不同，有待进一步研究。

4 结 论

以20个玉米自交系为材料，通过以玉米出苗期的早春低温播种相对出苗率和室内10 ℃相对萌发率、芽期存活率和苗期生理指标的增加幅度共计6个耐冷指标作为评价标准，对自交系进行了出苗期、芽期和苗期耐冷性综合鉴定评价。通过聚类分析发现，自交系辽1412、辽6049、辽7980、辽2386和中106耐冷性较强，自交系PH 6 WC、辽6027、C 8605-2、辽88、辽68、沈137、铁9010、辽2345和郑58耐冷性中等，自交系S 121、黄早4、K 12、辽6082、辽2309和辽511耐冷性弱。本试验为建立耐冷玉米种质鉴定技术体系奠定了重要基础，同时为玉米耐冷种质资源改良提供了重要材料。