十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴的安全性初探

李晓霞，王志萍，蒋雅娴，苏佳昇，施显怡

(广西中医药大学 广西高校中药制剂共性技术研发重点实验室,广西 南宁 530001 )

0 引言

十一方药酒是广西中医药大学第一附属医院的院内制剂，由三七、续断、红花、自然铜 (煅)、马钱子等中药组成，其跌打止痛、消肿散瘀的效果显著，但药酒容易污染衣物[1,2]，为了克服这一缺点，研制其成为十一方巴布剂.

十一方巴布剂系用十一方药酒与适宜的亲水性基质混匀后，涂布在背衬材料上制成的贴膏剂.本课题组在前期的研究中确定了十一方巴布剂的基质处方和制备工艺，主要以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、聚维酮K30(PVP-K30)、高岭土、甘油作为基质，再加入十一方药酒进行制备.

此外考虑到石墨烯具有优异的导热和导电性能[3-6]，而十一方巴布剂作为外用剂型应用，热敷后可充分发挥十一方巴布剂的药效，并且提高患者的顺应性，故本课题组拟将十一方巴布剂与石墨烯热敷贴联用.但联用前后的安全性如何呢?为了探讨该问题，本课题组开展十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴的安全性评价的实验研究，现报道如下.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SD大鼠，SPF级，50只，雌雄各半，体重180～220 g(广西医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SYXK桂2014-0002)；豚鼠(纯白)，80只，雌雄各半，体重350～400 g(由长沙市天勤生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)20140010).

1.1.2 实验药物与试剂

十一方巴布剂(自制，批号：20170701)；空白巴布剂(自制，批号：20170701)；石墨烯热敷贴(烯旺新材料科技有限公司提供)；2，4-二硝基氯苯(上海化学试剂厂分装厂，批号：120807)；乙醇消毒液(广西北仑河医科工业集团有限公司，批号：20170101)；水合氯醛(成都市科隆化学品有限公司，批号：2017030302)；硫化钠(成都市科龙化工试剂厂，批号：2016081601)等.

1.2 实验方法

1.2.1 急性毒性试验

(1)给药剂量

空白组给予140 cm2·kg-1的空白基质；巴布剂组给予140 cm2·kg-1的十一方巴布剂(相当于十一方药酒8.4 mL·kg-1)；联用组给予140 cm2·kg-1的十一方巴布剂并联用石墨烯热敷贴，热敷时间为2 h.

(2)试验方法[7-11]

分别采用完整皮肤与破损皮肤2种方法进行试验，每种方法均取大鼠18只，雌雄各半，随机分为3组，即空白组、巴布剂组、联用组，每组6只.于给药前24 h，采用完整皮肤进行试验的各组大鼠背部用剃毛器剃短，再外涂8%的硫化钠保持1 min左右，然后用温水洗净，吹风机吹干，脱毛面积约为4 cm × 7 cm.脱毛后饲养24 h，检查脱毛区皮肤是否有损伤，若大鼠皮肤有损伤则剔除.

采用破损皮肤进行试验的各组大鼠背部采用相同方式进行脱毛，脱毛面积约为4 cm × 7 cm，再用75%的乙醇消毒，用注射器针头在皮肤上划出“#”划痕，以渗血为度，每只大鼠皮肤破损程度应基本一致.给药前各组大鼠均以10%的水合氯醛，0.3 mL/100 g进行麻醉，再用温水洗净脱毛区皮肤，然后按给药剂量在大鼠脱毛区皮肤给药，并使药物与皮肤良好接触，用医用胶带固定.给药24 h后，除去药物，用温水洗净给药区残留的药物.给药后，正常饲养14天，分别记录给药前(D0)，给药后第7天(D7)，给药后第14天(D14)大鼠的体重，并观察大鼠外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、饮食、排泄物等及其他中毒表现.大鼠若有死亡，立即进行解剖学检查，观察脏器病变情况，当脏器有肉眼可见病变时，进行病理组织学检查.

1.2.2 皮肤刺激性试验

(1)给药剂量

巴布剂组给予70 cm2·kg-1的十一方巴布剂(相当于十一方药酒4.2 mL·kg-1)；联用组给予70 cm2·kg-1的十一方巴布剂并联用石墨烯热敷贴，热敷时间为2 h.

(2)试验方法[7-11]

分别采用完整皮肤与破损皮肤2种方法进行试验，以同体背部左右两侧进行自身对比，背部右侧脱毛区作为给药区，按剂量进行给药；左侧作为对照区，给予相同面积的空白基质.每种方法均取豚鼠12只，雌雄各半，随机分为2组，即巴布剂组、联用组，每组6只.给药前，采用完整皮肤进行试验的各组豚鼠背脊左右两侧用剃毛器将毛剃短，再外用8%的硫化钠1 min左右，然后用温水洗净，吹风机吹干，脱毛面积约为7 cm × 8 cm.脱毛后饲养24 h，检查脱毛区皮肤是否有损伤，若豚鼠皮肤损伤则剔除.

采用破损皮肤进行试验的各组豚鼠背脊左右两侧也进行脱毛，脱毛面积约为7 cm × 8 cm，再用75%的乙醇消毒，用注射器针头在皮肤上划出“#”划痕，以渗血为度，每只大鼠皮肤破损程度应基本一致.给药前各组豚鼠均以温水洗净脱毛区皮肤，然后在豚鼠背部右侧脱毛区按剂量给药，在背部左侧脱毛区给予相同面积的空白基质，并使之与皮肤良好接触，用医用胶带固定，每天给药1次，每次6 h，连续给药7 d，每次给药结束后去除药物，再以温水洗净给药区残留的药物.于第1天(D1)给药结束后1 h和24 h观察给药部位有无红斑和水肿等症状，再于第7天(D7)末次给药结束后1 h、24 h、48 h、72 h观察给药部位有无红斑和水肿等症状，以及上述症状的消退情况和时间.所出现的症状根据表1的评分标准进行评分，并按公式(1)计算刺激反应平均分值.

刺激反应平均分值=

(1)

平均分值0～0.49为无刺激性；0.5～2.99为轻度刺激性；3.0～5.99为中度刺激性；6.0～8.0为高度刺激性.

1.2.3 皮肤过敏性试验

(1)给药剂量

空白组给予70 cm2·kg-1的空白基质；阳性药组涂敷1%的2，4-二硝基氯苯(DNCB)0.5 mL/只；巴布剂组给予70 cm2·kg-1的十一方巴布剂(相当于十一方药酒4.2 mL·kg-1)；联用组给予70 cm2·kg-1的十一方巴布剂并联用石墨烯热敷贴，热敷时间为2 h.

表1 皮肤刺激、过敏反应评分标准

(2)试验方法[7-11]

取24只豚鼠，雌雄各半，随机分为巴布剂组、联用组、空白组、阳性药组，每组6只，雌雄各半.于试验前24 h，各组豚鼠背部脊柱两侧进行脱毛，左侧用于致敏接触，右侧用于激发接触，脱毛面积约7 cm ×8 cm.脱毛后饲养24 h，检查脱毛区皮肤是否有损伤，若豚鼠皮肤损伤则剔除.给药前各组豚鼠均以温水洗净脱毛区皮肤.

致敏接触：各组豚鼠按剂量在左侧脱毛区进行致敏接触，空白组贴敷空白基质；阳性药组涂敷1%的2，4-二硝基氯苯(DNCB)，并用一层油纸和二层医用纱布覆盖；巴布剂组给予十一方巴布剂；联用组给予与巴布剂组相同剂量的十一方巴布剂并联用石墨烯热敷贴，热敷时间为2 h.各组豚鼠给药后均用医用胶带将药物固定，然后将所有豚鼠分笼饲养，维持6 h，并于第7 d和第14 d，以同样的方法重复给药一次.

激发接触：各组豚鼠于致敏接触阶段末次给药后第14 d，按剂量在右侧脱毛区进行激发接触，空白组贴敷空白基质；阳性药组涂敷1%的2，4-二硝基氯苯(DNCB)0.5 mL/只，并用一层油纸和二层医用纱布覆盖；巴布剂组给予十一方巴布剂；联用组给予与巴布剂组相同剂量的十一方巴布剂并联用石墨烯热敷贴，热敷时间为2 h.各组豚鼠给药后均用医用胶带将药物固定，然后将所有豚鼠分笼饲养，激发6 h后，除去药物，用温水洗净给药部位皮肤，即刻观察皮肤反应情况，并于24 h、48 h、72 h再次观察皮肤过敏反应情况.同时注意观察实验动物是否有哮喘、站立不稳或休克等严重的全身性过敏反应，并根据表1的评分标准进行评分，再按公式(2)和公式(3)计算过敏反应平均分值和致敏发生率.

过敏反应平均分值=

(2)

过敏反应发生率=

(3)

过敏发生率0%～10%为无致敏性；11%～30%为轻度致敏性；31%～60%为中度致敏性；61%～80%为高度致敏性；81%～100%为极度致敏性.

2 结果与讨论

2.1 急性毒性试验结果

试验期间各组大鼠均未出现死亡，眼、鼻等未发现有异常分泌物，亦未发现大鼠的活动、饮食及其粪便等有明显异常情况.完整皮肤的给药组与空白组比较，在给药24 h后去除药物立即观察，以及给药后第7天和第14天观察，给药部位皮肤均未见红斑、水肿、出血点等情况.破损皮肤的给药组与空白组比较，给药24 h后去除药物立即观察，除划伤处皮损开始结痂外，其余皮肤均未见任何红斑、水肿、出血点等情况；给药后第7天和第14天观察，结痂开始脱落，其余皮肤均未见任何红斑、水肿、出血点等情况.试验期间各组的大鼠体重均稳定增长，且与空白组比较均无明显差异(P>0.05).结果如表2所示.

表2 十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴对大鼠体重的影响

注：各给药组大鼠体质量与空白组比较均无明显差异(P>0.05).

十一方巴布剂是由十一方药酒改制而成，其处方中含有有毒成份马钱子.马钱子所含的主要成分马钱子碱和士的宁既是有效成分又是有毒成分，而且治疗剂量与中毒剂量非常接近[12]，其临床应用的毒副反应报道也较多.由试验可知，十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴对完整皮肤和破损皮肤大鼠均无急性毒性，可说明马钱子的用量在其治疗剂量内.

2.2 皮肤刺激性试验结果

试验期间各组豚鼠均未出现死亡.完整皮肤联用组和巴布剂组无论是单次给药还是连续给药7天，在各个观察时间点均未见给药部位皮肤出现红斑、水肿、出血点等情况.破损皮肤联用组和巴布剂组单次给药和连续给药7天，都仅在给药结束后1 h内，个别豚鼠给药部位出现勉强可见的红斑，而且在24 h内消退，其余豚鼠在各个观察时间点均未见给药部位皮肤出现红斑、水肿、出血点等情况.评分结果如表3所示.

结果表明，十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴单次用药和连续用药均对豚鼠破损皮肤无刺激性，但是破损皮肤用药初期会有轻微、短暂的刺激性.其原因为十一方巴布剂是应用十一方药酒制成，含有易刺激破损皮肤的成分——酒精，并且其含量较少，故只产生短暂的刺激性.

表3 十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴对豚鼠的皮肤刺激性试验结果

2.3 皮肤过敏性试验结果

试验期间各组豚鼠均未出现休克和死亡.各组豚鼠在激发接触6 h后的0 h、24 h、48 h、72 h观察皮肤过敏反应情况，结果发现空白组、联用组和巴布剂组在72 h内均未出现红斑、水肿及其它过敏反应症状.阳性药组在激发接触6 h后立即观察，所有豚鼠均出现过敏反应症状(过敏发生率100%)，且出现站立不稳症状，给药部位皮肤出现重度红斑和重度水肿，水肿皮肤隆起1 mm左右，轮廓清晰；24 h后给药部位皮肤红斑并未减轻，水肿依然明显可见；48 h后给药部位皮肤的过敏反应症状有所减轻，表现为中度红斑和中度水肿，明显可见；72 h后给药部位皮肤的过敏反应症状消退明显，表现为轻度红斑和轻度水肿，勉强可见.评分结果如表4所示.

表4 十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴对豚鼠的皮肤过敏性试验结果

十一方药酒中含有的三七口服时有相关致敏性的报道，但外用致敏报道较少.其另一成分续断有因其个体的特异性产生过敏的研究，为了确保制剂的安全性，课题组进行了皮肤过敏性试验.结果显示受试豚鼠均未出现红斑、水肿及其它过敏反应症状，提示十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴对豚鼠皮肤无致敏性.

3 结论

本实验验证了十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴是一种无毒、无刺激、无致敏，安全性较好的外用制剂，为其开发成外用制剂打下了良好基础.