小花棘豆Alternaria oxytropis内生真菌酵母氨酸还原酶基因的Southern blot检测分析

珠丽，卢萍，席领军，高峰，李玉玲，姜凯

（内蒙古师范大学生命科学与技术学院，内蒙古呼和浩特 010022）

小花棘豆（Oxytropis glabra DC.）是豆科棘豆属多年生草本植物，许多植株内含生物碱苦马豆素（swainsonine，SW），国际上将含SW的棘豆属（Oxytropis）、黄芪属（Astragalus）等有毒植物统称为疯草，而SW是引起动物疯草病的唯一毒素[1]。SW阳离子半椅式构象与甘露糖阳离子构象类似，可与甘露糖苷竞争性结合抑制α-甘露糖苷酶Ⅰ和高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ的活性[2]，造成细胞功能紊乱，使牲畜出现中毒症状，严重时致死。通过对小花棘豆的研究发现，凡能够分离或检测到Alternaria oxytropis内生真菌的植株均含SW，且体外培养该内生真菌合成了SW，从而提出小花棘豆的SW毒性由该内生真菌引起。

疯草内生真菌酵母氨酸还原酶基因（saccharopine reductase gene，sac）编码酵母氨酸还原酶[3-4]催化赖氨酸转化为酵母氨酸后，生成的α-氨基己二酸半醛是内生真菌合成SW的一个重要前体[5]。前期实验中克隆到A.oxytropis的sac cDNA（KJ944635）和基因（KY052048），获得sac缺失突变体M1，发现酵母氨酸还原酶促进真菌SW的合成。

Southern blot由Southern[6]于1975年创建，是分析基因结构和检测特定DNA片段的经典技术，可检测外源目的基因是否已转入并整合到生物染色DNA上，同时可对外源片段拷贝数进行分析。Southern blot中使用的标记探针有放射性同位素和非放射性两类，其中放射性探针灵敏度较高，但半衰期短，且有放射性辐射；非放射性标记又分为生物素标记和地高辛标记，非同位素标记探针可避免放射性危害，且由于生物体内没有地高辛，可更好地消除内源背景，应用效果更好[7]。

Southern blot操作程序繁琐，对基因组DNA的提取、纯化、酶切等均有较高要求，要获得理想杂交结果需反复摸索，虽可使用相关试剂盒，但需根据具体情况优化杂交方案。本研究利用PCR制备地高辛（DIG）标记探针，并对Southern blot方法进行了探索和优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌种

供试菌种：小花棘豆A.oxytropis内生真菌野生株OW7.8和sac缺失突变株M1由本实验室提供。

1.1.2 主要试剂

质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒，购自Axygen；真菌基因DNA 提取试剂盒、核酸共沉剂、限制性酶、6×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker，购自Takara；核酸染料购自Bio TAQ；DIG标记试剂盒、Hyb高效杂交液，购自北京美莱博医学科技；氨苄青霉素、潮霉素 B，购自sigma；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3 主要仪器

超净工作台ZHJH-1109 型，上海智城分析仪器制造有限公司生产；真菌培养箱MGC-350BP-2型，上海一恒科技有限公司生产；冷冻离心机3-18K/D-37520 型，德国 SIGMA生产；超微量测浓仪Q5000型，美国 Quawell生产；PCR 扩增仪050-810Tgradient48 型，德国Biometra-grandien生产；全自动高压灭菌锅HVE-50 型，日本 HIRAYAMA生产；电泳仪BG-Power 600型，北京百晶生物技术有限公司生产；凝胶成像系统BG-gds AUTO，北京百晶生物技术有限公司生产；超声波清洗器PS-20，洁康超声波设备有限公司生产；Hybridization oven OV4000，德国耶拿分析仪器公司生产；隔水培养箱GH6000，天津泰斯特仪器生产。

1.2 方法

1.2.1 PCR法制备DIG标记探针

根据内生真菌sac中间序列设计特异性引物DSF/DSR和SEMF/SEMR，以pTOPO-sac1（含内生真菌sac）为模板制备野生型探针。PCR反应体系为：pTOPO-sac11.0 μg，10×PCR Buffer 2.0 μL，DigdUTP 1.0 μL，rTaq酶1.0 μL，上下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），ddH2O补足至20 μL。引物DSF/DSR的PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s； 57 ℃30 s；72 ℃ 1 min，30次循环；72 ℃ 10 min。引物SEMF/SEMR的PCR反应条件：95 ℃ 5 min，（95 ℃30s，62 ℃ 30s，72 ℃ 30s）×30，72 ℃ 10 min。

根据pCB1003（含hph）质粒上的hph序列设计特异性引物HGF/YGR，以质粒为模板制备突变型探针。PCR反应体系除模板其余与上面体系相同。PCR反应条件与DSF/DSR的相同。引物序列见表1。

在做标记反应的同时，做一个相同体系非标记PCR。反应结束后取标记和非标记PCR的扩增产物进行电泳检测（1%琼脂糖），剩余探针保存于-20 ℃，用于后续实验。

表1 PCR引物序列

1.2.2 基因组DNA提取、酶切与转膜

（1）真菌基因组DNA提取

将OW7.8和M1接种于PDA培养基上，M1培养基含潮霉素B（终浓度为50 μg/mL），接种后置于25 ℃培养箱中培养14 d。

刮取50 mg菌丝体放入预冷研钵中，加液氮迅速研磨至粉末，后置离心管中，加500 μL 4×CTAB提取液（含1% β-巯基乙醇）、4 μL RNase（100 mg /mL）充分摇匀，65 ℃水浴保温40 min，再加等体积酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）混匀，4 ℃12000r/min离心5 min。在上清液中加2.5倍体积预冷无水乙醇，4℃12000r/min离心15 min，弃上清液。70%乙醇离心洗涤两次，4℃12000r/min离心5 min，弃上清液，80℃烘10 min，加100μL ddH2O，37 ℃水浴1 min，测定DNA浓度及OD值，取5μL进行电泳检测。

（2）基因组DNA限制酶切反应

选择限制性内切酶Eco RⅤ、Pst Ⅰ、Pci Ⅰ、PvuⅡ进行酶切反应，总体积50 μL，反应体系见表2和表3。基因组DNA终浓度调至20 ng，于37 ℃酶切12 h，视情况延长反应时间至完全酶切，65 ℃保温10 min，停止反应。使用核酸共沉剂进行酶切产物的纯化和浓缩，用琼脂糖凝胶电泳检测（0.8%）。

表2 OW7.8基因组DNA酶切反应体系

（3）转膜和固定

向上毛细管转移20 h以上。转膜结束后，用凝胶成像系统检测效果。取膜，切右上角标示方向。将尼龙膜浸入6×SSC溶液中5 min，80 ℃烘烤2 h，进行膜固定，固定后用于杂交。

表3 突变株株基因组DNA酶切反应体系

1.2.3 Southern blot

加Hyb高效杂交液50 ℃预杂交3 h（15 r/min）以封闭非特异性位点。标记好的探针（25 ng/mL）沸水浴10 min后立即冰浴10 min备用。倒掉预杂交液，加入50 ℃ 5 mL Hyb高效杂交液及变性地高辛标记探针（1～3 μL/膜，5～20 ng探针/mL Hyg杂交液）混匀，50 ℃杂交过夜。

取出尼龙膜50 ℃水浴震荡洗涤，室温封阻尼龙膜30 min、结合抗体30 min、洗抗体两次（15 min/次），加300μL NBT/BCIP显色底物于37 ℃培养箱中避光显色20 h后，短时间暴露于光下用50 mL ddH2O洗膜5 min，停止显色，拍照记录[8-12]。

2 结果

2.1 PCR法制备地高辛（DIG）标记探针

内生真菌sac探针电泳结果如图1所示，泳道1为非标记sac PCR反应产物，泳道2为DIG标记的sac探针，其电泳条带约709 bp，与预期结果相同。hph探针电泳结果如图2所示，泳道1为DIG标记的hph探针，泳道2为同样条件下的非标记PCR反应产物，电泳条带约879 bp，与预期结果相同。标记反应PCR产物中带非同位素的配体（生物素、地高辛等），其电泳迁移率慢于非标记PCR产物。

图1 OW7.8探针DNA琼脂糖凝胶电泳图

图2 M1探针DNA琼脂糖凝胶电泳图

2.2 OW7.8及M1基因组DNA限制性酶切与转膜

将提取的OW7.8和M1基因组DNA（终浓度为20.75±7.64 μg）用Eco RⅤ、Pst Ⅰ、Pci Ⅰ和Pvu Ⅱ限制酶进行切割，酶切产物浓度为202.6±13.8 ng/μL，OD 260/OD 280在1.88～2.01，电泳结果如图3所示。其中泳道1为野生株基因组DNA，泳道2、3为用限制酶Eco RⅤ、Pst Ⅰ酶切OW7.8基因组DNA后产物，由图可见酶切后泳道呈弥散状，无明显条带，说明酶切效果较好。泳道4、5为使用限制酶为Pci Ⅰ、Pvu Ⅱ酶切M1基因组DNA后的产物，结果显示泳道4酶切反应不完全，泳道5酶切反应完全。分别将OW7.8基因组用限制酶Eco RⅤ再进行酶切，将M1基因组用限制酶PciⅠ再进行酶切，结果如图4，可看到酶切反应进行彻底。转膜后观察凝胶结果如图5，凝胶上没有任何残留DNA，说明酶切产物已全部移至尼龙膜。

图3 基因组DNA酶切产物

图4 基因组DNA酶切产物

图5 转膜后的凝胶

2.3 Southern blot

由内生真菌sac特异性探针与M1基因组DNA和OW7.8基因组DNA酶切产物进行Southern blot试验，结果如图6所示。泳道1表示sac探针与Pvu Ⅱ切割M1基因组DNA杂交，杂交结果呈阴性，表明M1中sac已被敲除；泳道2和3分别用Eco RⅤ和Pst Ⅰ切割OW7.8基因组DNA进行杂交，杂交结果呈阳性，说明野生株有sac，且基因的拷贝数为1。

由hph特异性探针与M1基因组DNA和OW7.8基因组DNA酶切产物进行Southern blot试验，结果如图7所示。泳道1表示hph探针与Pvu Ⅱ切割M1基因组DNA杂交，发现M1杂交结果呈阳性，说明标记基因hph成功整合到M1基因组中；泳道2和泳道3分别用hph特异性探针与Eco RⅤ和Pst Ⅰ切割的OW7.8基因组DNA杂交，结果呈阴性，OW7.8基因组中无hph，M1中sac已被敲除，且标记基因hph已整合到基因组上。

图6 野生型探针杂交

图7 突变型探针杂交

3 讨论与结论

Southern blot过程较繁琐，需注意细节颇多，本研究用PCR法制备DIG标记探针时设计了6对特异性引物，经优化选择出两对特异性高且扩增产物长度适宜的引物，发现若扩增产物低于300 bp，则DIG掺入较少，而探针过长则DIG掺入过多，导致非特异性杂交。张明琴等[8]用900 bp探针进行杂交，杂交信号较强。另外，在探针标记前要优化PCR反应条件，包括引物、退火温度、延伸时间、模板量等，减少非特异性扩增，从而降低杂交背景值，避免出现假阳性。

Southern blot对基因组DNA的质量要求高，本研究在CTAB法基础上进行了改进[9]，菌丝研磨要充分快速（2 min内），避免降解；涡旋振荡使菌丝与裂解液混匀，使DNA充分释放。对裂解时间也进行了探索，发现40 min利于基因组DNA释放。

实验中在45～65 ℃范围内设置了5个温度，发现50 ℃时杂交效果最好。杂交膜的选择也相当重要，试验发现使用尼龙膜比硝酸素纤维膜的杂交信号强。杂交液纯度也会影响杂交结果，分别用过滤前后的杂交液进行杂交，发现过滤后的杂交背景低、无假阳性、杂交信号较强，而未过滤杂交液则背景值高、无杂交信号。杂交膜用TE漂洗2次后封存，膜干燥或久置后，信号将会有所减弱或褪色，但经TE润湿后仍然会重现原有的杂交信号[10]。

Hyb高效杂交液适合在带正电荷尼龙膜上进行Southern和Northern杂交分析，其独特配方和操作规程仅需杂交6～12 h，而常规杂交则需要12～24 h。另外，Hyb高效杂交液能明显降低背景，使Southern膜上单拷贝基因和Northern膜上低拷贝RNA得以检出，也适于各类cDNA表达芯片杂交和探针标记。

设计DIG标记探针，利用Southern blot技术检测了小花棘豆内生真菌OW7.8和M1菌株，结果表明OW7.8中有sac中间序列，而在M1中被hph替换，说明sac已被敲除。sac基因以单拷贝形式存在于OW7.8基因组中。