朝鲜当归提取物对小鼠脑缺血-再灌注损伤神经的保护作用及其机制*

程永杰，赵子瑞，李晓妮，吉海杰

(1.山西药科职业学院药学系，太原 030031；2.山西医科大学药学院，太原 030001；3.山西省中医药研究院，太原 030012)

脑卒中是世界范围内威胁公众健康的疾病之一。缺血性脑卒中病灶由缺血核心区及周围缺血半影区组成；缺血核心区神经元损伤不可逆，而半影区损伤能够通过及时治疗得到挽救[1]。新生血管生成可使阻塞微血管再通，促进半影区损伤神经元恢复[2]。血管生成是由血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成素1(angiopoietin-1，Ang-1)等调节[3]。研究表明，小鼠脑卒中后全身炎症加剧，可降低血-脑屏障紧密连接[4]。VEGF可促进血管生成，抑制缺血神经元损伤，还具有抗炎作用[5]。Ang-1是内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体Tie-2配体[6]。Ang-1和VEGF联合具有协同作用，促进血管生成和新生血管成熟。朝鲜当归(AngelicagigasNakai)为伞形科植物朝鲜当归的根。朝鲜当归主要含紫花前胡素、紫花前胡醇当归酯、7-去甲基软木花椒素、异紫花前胡内酯和紫花前胡醇[7]。朝鲜当归具有一些生物活性，如神经保护、抗炎和抗氧化等[8-9]。然而，朝鲜当归对血-脑屏障通透性和血管生成影响笔者未见相关报道。因此，本研究旨在评价朝鲜当归提取物是否通过调节血-脑屏障通透性和血管生成在小鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)诱导缺血-再灌注(ischemia/reperfusion，I/R) 损伤中发挥神经保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 雄性清洁级C57BL/6小鼠，体质量25～30 g，自由饮食和饮水，室温(23±1) ℃。所有动物均由山西医科大学动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(晋) 2015 -0001。将小鼠通过随机数字表法分为6组，分别为假手术组、模型对照组和朝鲜当归(10，25，50，100 mg·kg-1)组，每组各9只。

1.2试剂 朝鲜当归(亳州市保华药业有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenylterazolium chloride,TTC)染料(美国Sigma公司，批号：00281342)；Ang-1(美国Santa公司，批号：SC-319824)；VEGF(美国Santa公司，批号：SC-7269)；CAM-1(美国Santa公司，批号：SC-7974)；ZO-1(美国Santa公司，批号：I0214)；Occludin(美国Santa公司，批号：SC-8144)。

1.3方法

1.3.1朝鲜当归提取物的制备 将朝鲜当归根部用纯化水煮3 h，通过双层滤网过滤到Whatman滤纸(杭州雷琪实验仪器有限公司，型号：2105-862)上，在真空下浓缩。最终产生的浓缩提取物是29.1%干燥粉末，干燥粉末在4 ℃冰箱中保存，使用前溶解于0.9%氯化钠溶液中。

1.3.2I/R模型制备 小鼠I/R模型制备方法：1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，然后颈部行正中纵切口，显微镜下暴露左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，用丝线结扎颈总动脉近心端和颈外动脉远心端，将线栓从小孔插入颈总动脉，上升至颈内动脉，最后到达大脑中动脉，固定线栓，90 min后拔出线栓，最后缝合切开皮肤[10]。I/R手术成功率约为70%。假手术组和模型对照组大鼠手术步骤一样，只是不插线栓。小鼠MCAO手术90 min后分别灌服不同剂量(10，25，50和100 mg·kg-1)朝鲜当归提取物(0.9%氯化钠溶液溶解)，再灌注24 h后麻醉处死，进行相关检测。

1.3.3脑梗死体积测定 再灌注24 h后，迅速将动物断头取脑，将脑组织置于冰箱-20 ℃冷冻10～15 min，自前脑额极起用锋利刀片切成冠状切片，每片厚约1.5 mm，将脑片置于0.5%TTC染色液中，于37 ℃下孵育30 min。脑片用扫描仪扫描，用image pro plus 软件对脑片梗死体积进行分析[11]。

1.3.4Western blotting分析 再灌注24 h后，通过试剂盒提取小鼠半影区总蛋白，取20 μg蛋白行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳分析，电泳后转至聚偏二氟乙烯膜上。然后分别加入兔抗Ang-1、VEGF、ZO-1和Occludin多克隆抗体(1：1000)和鼠抗……-actin多克隆抗体(1：5000)孵育。再加入山羊抗兔和山羊抗鼠的二抗(1：5000)，室温孵育。最后用化学发光系统检测，应用Quantity one软件对吸光度进行评估。

2 结果

2.1朝鲜当归提取物对I/R小鼠脑梗死体积影响 采用TTC染色观察I/R小鼠脑梗死体积变化。模型对照组相对脑梗死体积为(29.7±5.2)%。10，25，50和100 mg·kg-1朝鲜当归组小鼠相对脑梗死体积分别为(31.1±5.6)%，(24.0±3.9)%，(18.5±5.8)% 和(15.8±3.7)%(图1)。与模型对照组比较，50和100 mg·kg-1朝鲜当归提取物可以显著减小脑梗死体积(F=13.84，P<0.01)。

图1 5组小鼠脑梗死情况(典型TTC 染色图)

Fig.1Cerebralinfarctioninfivegroupsofmice(representativeimagesofTTCstaining)

2.2朝鲜当归提取物对I/R小鼠血管生成调节蛋白影响 如图2所示，与假手术组比较，模型对照组Ang-1表达显著降低(F=19.21，P<0.01)。与模型对照组比较，25，50 和 100 mg·kg-1朝鲜当归提取物处理后Ang-1(F=19.21，P<0.01)和VEGF(F=22.63，P<0.01)表达明显增加。此外，与模型对照组比较，100 mg·kg-1朝鲜当归处理后p-Akt(F=15.07，P<0.01)和PI3K(F=17.52，P<0.01)表达明显增高(图3)。如图4所示，与假手术组比较，模型对照组ZO-1(F=12.74，P<0.01)和Occludin(F=16.16，P<0.01)表达显著降低；朝鲜当归治疗后ZO-1表达明显增高，呈剂量依赖性(F=17.89，P<0.01)。

A.假手术组；B.模型对照组；C.朝鲜当归10 mg·kg-1组；D.朝鲜当归25 mg·kg-1组；E.朝鲜当归50 mg·kg-1组；F.朝鲜当归100 mg·kg-1组；①与假手术组比较，P<0.01；②与模型对照组比较，P<0.01。

图2 6组小鼠Ang-1和VEGF表达比较

A.sham operation group；B.model control group；C.Angelica gigas Nakai 10 mg·kg-1group；D.Angelica gigas Nakai 25 mg·kg-1group；E.Angelica gigas Nakai 50 mg·kg-1group；F.Angelica gigas Nakai 100 mg·kg-1group;①Compared with sham operation group,P<0.01；②Compared with model control group,P<0.01.

Fig.2 Comparison of the expression of Ang-1 and VEGF among six groups of mice

2.3朝鲜当归提取物对I/R小鼠血-脑屏障通透性影响 如图5所示，伊文思兰染色显示，与假手术组比较，模型对照组血-脑屏障通透性增大(F=48.62，P<0.01)；25，50 和 100 mg·kg-1组血-脑屏障通透性显著降低(F=48.62，P<0.01)。

3 讨论

本研究显示，朝鲜当归对I/R小鼠神经具有保护作用。VEGF是血管生成的关键调节因子。在中枢神经系统，VEGF促进血管内皮细胞增殖和存活，使伤口愈合，并在脑损伤修复中促进星形胶质细胞增殖[12]。局灶性脑缺血中检测到Ang-1和 Ang-2表达，Ang-1具有保护血管通透性作用，还可以激活Tie-2受体，发挥抗炎作用[13]。PI3K/Akt通路激活Tie-2信号转导通路，使血管血管通透性保持稳定；血管生成调节因子VEGF和Ang-1不能直接调节内皮细胞生长，但是通过PI3K/Akt通路调节内皮细胞生长[14]。与VEGF不同，Ang-1主要在血管发育阶段发挥作用，例如血管重塑和成熟。本研究中，朝鲜当归提取物可增加I/R小鼠缺血半影区VEGF和 Ang1表达。刺激小鼠脑VEGF和Ang-1 表达可增加微血管密度，大剂量VEGF和Ang-1联合使用促进缺血状态下血管形成[15]。本研究表明，朝鲜当归促进缺血性脑损伤后血管生成，主要是通过增加VEGF和Ang1的表达。

A.假手术组；B.模型对照组；C.朝鲜当归10 mg·kg-1组；D.朝鲜当归25 mg·kg-1组；E.朝鲜当归50 mg·kg-1组；F.朝鲜当归100 mg·kg-1组；①与假手术组比较，P<0.01；②与模型对照组比较，P<0.05；③与模型对照组比较，P<0.01。

图3 6组小鼠Akt和PI3K表达比较

A.sham operation group; B.model control group; C.Angelica gigas Nakai 10 mg·kg-1group; D.Angelica gigas Nakai 25 mg·kg-1group; E.Angelica gigas Nakai 50 mg·kg-1group; F.Angelica gigas Nakai 100 mg·kg-1group; ①Compared with sham operation group,P<0.01 ; ②Compared with model control group,P<0.05；③Compared with model control group,P<0.01.

Fig.3ComparisonoftheexpressionofAktandPI3Kamongsixgroupsofmice

A.假手术组；B.模型对照组；C.朝鲜当归10 mg·kg-1组；D.朝鲜当归25 mg·kg-1组；E.朝鲜当归50 mg·kg-1组；F.朝鲜当归100 mg·kg-1组；①与假手术组比较，P<0.01；②与模型对照组比较，P<0.01。

图4 6组小鼠ZO-1和Occludin表达比较

A.sham operation group; B.model control group; C.Angelica gigas Nakai 10 mg·kg-1group; D.Angelica gigas Nakai 25 mg·kg-1group; E.Angelica gigas Nakai 50 mg·kg-1group; F.Angelica gigas Nakai 100 mg·kg-1group;①Compared with sham operation group,P<0.01 ; ②Compared with model control group,P<0.01.

Fig.4ComparisonoftheexpressionofZO-1andOccludinamongsixgroupsofmice

A.假手术组；B.模型对照组；C.朝鲜当归10 mg·kg-1组；D.朝鲜当归25 mg·kg-1组；E.朝鲜当归50 mg·kg-1组；F.朝鲜当归100 mg·kg-1组；①与假手术组比较，P<0.01；②与模型对照组比较，P<0.01。

图5 6组小鼠血-脑屏障通透性比较

A.sham operation group; B.model control group; C.Angelica gigas Nakai 10 mg·kg-1group; D.Angelica gigas Nakai 25 mg·kg-1group; E.Angelica gigas Nakai 50 mg·kg-1group; F.Angelica gigas Nakai 100 mg·kg-1group;①Compared with sham operation group,P<0.01 ; ②Compared with model control group,P<0.01.

Fig.5Comparisonofblood-brainbarrieramongsixgroupsofmice

血-脑屏障是一个高度复杂的结构。一些神经系统疾病，如卒中、癫、阿尔茨海默病和脑肿瘤与血-脑屏障功能障碍有关[16]。此外，血-脑屏障损伤有助于继发性炎症和神经元损伤，从而促使疾病发展。在本研究中，朝鲜当归提取物处理减少I/R小鼠血-脑屏障破坏。紧密连接蛋白是血-脑屏障内皮细胞之间一种有效的屏障。在生理和病理条件下，紧密连接蛋白表达、亚细胞定位、翻译后调节和蛋白质-蛋白质相互作用会发生变化[17]。朝鲜当归提取物促进缺血脑组织中ZO-1和Occludin蛋白表达，呈剂量依赖性关系。因而朝鲜当归提取物可以有效预防I/R小鼠血-脑屏障损伤引起的神经元损伤。此外，朝鲜当归主要含有紫花前胡素、紫花前胡醇当归酯、7-去甲基软木花椒素、异紫花前胡内酯和紫花前胡醇，均为香豆素类化合物，可抑制诱导型一氧化氮合酶、白细胞介素-1和环氧化酶-2等[18]。由于朝鲜当归具有抗炎作用，也可能在缓解I/R小鼠血-脑屏障损伤引起的神经元损伤中发挥作用。

总之，朝鲜当归可激活PI3K/Akt通路，增加血管生成诱导蛋白Ang-1、VEGF 和紧密连接蛋白ZO-1和 Occludin表达，因而具有减小I/R引起的脑梗死体积及血-脑屏障通透性等作用。