荧光互补技术在活细胞中研究蛋白质相互作用的应用

王菲

（聊城大学生命科学学院，山东 聊城252000）

蛋白质是构成组织细胞的基本物质，也是机体生长发育、组织更新等生命活动的承担者。生命活动的执行并不是基于单一蛋白质，蛋白质间复杂的相互作用几乎介导了所有活细胞中的生命活动。由此可见，研究深入了解PPI 对人类社会的发展具有深远的意义。

1 蛋白质相互作用（PPI）

蛋白互作的鉴定及蛋白质在代谢中的作用，是蛋白质生化的热门领域。蛋白质之间的相互作用是由它们接触点的互补表面决定的，这种相互作用是折叠过程中所涉及的物理化学性质的结果，最终形成同源或异源寡聚体。这些结合位点具有平坦的拓扑结构，接触界面不均匀，只有少数残基提供能量，是它们相互作用亲和力的关键。研究发现，PPI 的结构域多态性较低，特别是与结合相关的残基。涉及PPI 的保守结构域的一个例子是PDZ(PSD-95、Dlg 和ZO-1 蛋白)，从细菌到人类的进化过程中，这个结构域被保存下来。在相互作用过程中，这些结构域与对应蛋白的羧基末端残基相互作用。同样，结构域也可以单独与其他结构域(如SH3 一样)相互作用，形成与信号级联有关的复合物。每种蛋白质都有能力激发几种PPI，表明蛋白质网络比基因组序列更复杂，此外，PPI 还具有动态性，同时性和继时性。利用荧光互补技术在活细胞内研究PPI 更为研究未知蛋白质的功能提供了强有力的工具。

2 BiFC 技术的起源及理论依据

2002 年，Hu 等经实验研究第一次提出BiFC 的概念。该实验采用的荧光蛋白是GFP 的突变子增强型黄色荧光蛋白（EYFP），将1 组相互作用的同向平行的Leu 拉链与从多个特定位点切开的EYFP 的碳端和氮端融合表达。结果表明，在氨基酸Ala154，Asp155 位切开与Leu 拉链共表达的融合蛋白，能够在活体内发出黄色荧光[1]。若没有融合蛋白间的相互吸引，单个GFP 片段不具荧光活性。用荧光蛋白构建BiFC 系统的关键是在荧光蛋白中找到合适的分割位点。通过对照实验，找出在蛋白质- 蛋白质相互作用恢复荧光时，能产生最亮的荧光切割处，然后将C 端和N 端与一对互相作用的目标蛋白共表达。当目标蛋白对相互作用时，N 和C 片段紧密相连，开始了片段N和C 之间的空间互补过程。因此，荧光蛋白分子被重构，最终允许在适当的激发波长下发出荧光，BiFC 技术由此建立起来。

3 应用

3.1 荧光互补技术在大肠杆菌中的应用

BiFC 系统建立后，2004 年，Tsuchisaka 等利用BiFC 技术研究9 个1- 氨基环丙烷-1- 羧酸合成酶（ACS）多肽是否可以构成异源二聚体，这些多肽由拟南芥基因组编码。该研究在大肠杆菌体内融合表达出不同多肽的y92a 和k278a 突变体，并用这些共表达产物进行分子间互补实验，实验数据显示它们可以形成异源二聚体。2007 年，Morell M等研究了蛋白间弱相互作用，采用了BiFC 技术和流式细胞术联合技术。该实验的研究对象是富含Pro 多肽p41 和c-Ab1 Tyr 激酶的一个结构域SH3，将黄色荧光蛋白（YFP）在第155 和156 位氨基酸处切割，分别与上述两个研究对象构建成表达载体p-p41-NYFP 和p-Abl-SH3-CYFP。以单转为对照，两个表达载体共转BL21（DE3）菌株体内。实验结果表明，单独的YFP 片段不具荧光活性，而存在共表达的BL21（DE3）内检测到黄色荧光[2]。

3.2 荧光互补技术在动物活细胞中的应用

双分子荧光互补在动物细胞内研究PPI 得到广泛应用。在细胞内蛋白质以特定的形式发挥其生物学功能。细胞内大量的细胞蛋白质是寡聚的，研究蛋白质寡聚为蛋白质功能的研究提供了重要的见解，而BiFC 是实现这一目的有力工具。α- 突触核蛋白的错折叠、寡聚和纤维蛋白化是帕金森病（PD）和其他相关神经疾病发生和发展的主要原因。通过在活细胞中应用BiFC，发现α- 核蛋白寡聚体的稳定性会增加细胞毒性，Hsp70可以在减少α- 核蛋白寡聚体形成，来减少细胞毒性。BiFC 在神经退行性疾病的分子基础研究中的应用能够直接显示活细胞中的α- 核蛋白寡聚体及其Hsp70 对其的调节作用，从而成为寻找治疗神经疾病的新工具。利用荧光互补系统了解寡聚是如何发生的，对于治疗疾病开发新的治疗方法至关重要。

3.3 荧光互补技术在植物活细胞中的应用

2003 年，Hu 等人提出了多色荧光蛋白互补技术，该技术的提出离不开BiFC 的基础。2004 年，Walter 等构建了多种表达载体研究植物蛋白互作[3]，这是首次报道BiFC 技术应用于拟南芥原生质体、烟草叶中。这些蛋白互作分析为BiFC 在不同细胞间隔中高效显示不同结构蛋白的可行性奠定了基础。经过发展，多个BiFC 系统运用到植物活细胞中，同时显示同一细胞内多种蛋白质相互作用。这种方法是基于不同光谱特征的荧光蛋白片段之间的互补。2008 年，Lee 等人的研究发现在烟草BY-2 原生质体、洋葱表皮细胞中，农杆菌病毒VirE2 与跨膜蛋白-4、拟南芥核转运蛋白都发生相互作用，不同的是前者互作的场所在细胞核，而后者发生于细胞质中。该结论的发现，是研究者利用了多色BiFC 技术，将Venus 和Cerulean 克隆到CFP 的N 端（nVenus 或nCerulean），靶蛋白克隆到CFP 的C 端，nVenus 和C- 端融合蛋白互作发出黄色荧光，C- 端融合蛋白和nCerulean作用处则呈现了蓝色荧光[4]。由此可见，多色BiFC 是一种有效的技术，可以同时确定一个给定的“诱饵”蛋白和多个“猎物”蛋白质在活的植物细胞中的相互作用。多色荧光蛋白互补技术在研究植物信号传导中也发挥着重要作用，对农业发展有着极大影响。

4 展望

近些年，BiFC 技术在PPI 研究中已经得到普遍应用，且发展迅速，并从多色荧光互补技术产生，到与其它技术如荧光共振能量转移，流式细胞术的联用，使其具有更加广泛的应用前景。