组织特异性增强子调控SOX9 基因表达的研究进展

2020-01-04 19:37陈启铭代杰文
口腔颌面外科杂志 2020年6期
关键词:性腺颌面表型

陈启铭, 代杰文, 卞 迁

(1. 上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院,口腔颅颌面科,国家口腔疾病临床研究中心,上海市口腔医学重点实验室,上海市口腔医学研究所;2. 上海精准医学研究院,上海 200011)

作为SOX 家族的成员,转录因子SOX9 通过激活细胞干性基因、调控细胞分化、维持细胞稳态等方式,在软骨、性腺等组织器官发育过程中起到了重要的作用,并且还同结、直肠癌等肿瘤的预后相关[1-2]。既往研究揭示,SOX9 单倍剂量不足是弯肢发育异常(campomelic dysplasia, CMPD)的致病因素[3]。该病是一种半致死性的软骨及骨发育障碍,其特征性表现包括胫骨弯曲、小下颌及气道狭窄等,同时亦可伴有性别反转。 SOX9 基因不同区段内非编码序列的转位、 微缺失等染色体结构异常还可分别导致Pierre Robin 序列征(Pierre Robin sequence, PRS)、单纯性别反转(disorders of sex development, DSD)等疾病的发生[4]。 因此,本文就已知的SOX9 基因相关增强子进行系统性论述, 聚焦不同增强子调控SOX9时空表达模式及机制的研究进展。

1 SOX9 基因三维结构、染色体结构异常及相关疾病

SOX9 基因位于人基因组17q24.3 上,其非编码序列的染色体结构异常,如微缺失、转位等已被证明与多种疾病相关。 根据对应的不同表型, 可将SOX9 上游的基因非编码区划分为不同的区间:弯肢发育异常相关区域(50~375 kb),无弯肢软骨发育异常相关区域 (789~932 kb), 性别反转相关区域(516~640 kb)及 Pierre Robin 序列征相关区域(1.06~1.23 Mb)[5-8]等。 这些疾病表型同 SOX9 在软骨、性腺发育中的核心调控地位相一致,且呈现出染色体结构异常发生的位置距离SOX9 越远, 疾病表型越轻的趋势。 染色体结构异常影响SOX9 的表达可能是通过改变三维基因组结构实现的[9]。 拓扑相关结构域(topologically associating domain, TAD) 作为染色体结构的基础性单位,包含一个或多个基因及其调控元件, 并通过富含CTCF 结合位点的边界(TAD boundary)彼此分隔,形成了基因调控的独立区域。小鼠SOX9 基因坐落于单独的TAD 内(SOX9 TAD),与其相邻的TAD 包含Kcnj2 和Kcnj16 两个钾离子通道相关基因(Kcnj TAD)[10]。 近期研究表明,当构建SOX9 TAD 内的倒位时, 可在小鼠模型上观察到骨及软骨发育异常、腭裂、指端发育不良的表型[11]。 值得注意的是,TAD 作为染色体三维结构和功能的基础性单元,虽然可通过缩短增强子及启动子间的距离促进增强子-启动子互作,但该互相作用还受到增强子性质、转录因子结合等因素的影响[12]。 因此,发掘调控SOX9 在不同组织中表达的增强子对于理解SOX9 的基因表达调控具有基础性意义。

2 SOX9 软骨特异性增强子

SOX9 对于软骨发育的核心转录调控作用贯穿于除肥大软骨细胞以外的诸多阶段[13]。 既往研究明确揭示了SOX9 与软骨相关的组织特异性增强子。如Yao 等[14]通过LacZ 报告小鼠显示E84 增强子在前肥大软骨细胞区域,如肋软骨中份、胫骨近端及腰椎等有显著的活性, 而E195 增强子报告小鼠则在软骨组织柱层及增殖层显色明显。 不同于以上2 种增强子报告小鼠的表达模式, 位于SOX9 上游250 kb 的增强子 E250 能够指导 LacZ 在前软骨细胞表达,其表达模式同E84 呈现互补。 以上研究结果表明,SOX9 上游含有调控其在软骨发育不同阶段的增强子, 以实现对SOX9 时空表达水平的调控。

SOX9 软骨相关增强子除了能调控其在软骨发育不同阶段的表达以外,亦对其在不同解剖部位的表达具有调控作用。 Mochizuki 等[15]发现在SOX9 上游约1 Mb 的区域内包含一个增强子元件, 该增强子指导LacZ 在肋骨、胸骨等胸腔软骨中特异性表达,因此被命名为RCSE 增强子(Rib cage-specific enhancer)。 敲除该增强子后可出现胸廓容积缩小、胸椎弯曲、肋骨短小等表型,组织学上表现为肥大软骨细胞层增宽,而增殖层缩短,提示RCSE 增强子特异性地调控SOX9 在胸腔软骨组织中的表达。

3 SOX9 颅颌面特异性增强子

除了在四肢及躯干的骨和软骨发育中发挥核心调控作用以外,SOX9 在颅颌面组织,特别是颅颌面骨组织的发生中亦起到了关键的作用。 与四肢及躯干骨不同的是,颌面部骨组织起源于颅神经嵴细胞(cranial neural crest cells, CNCCs), 且不同的颅颌面诸骨分别通过膜内成骨和软骨内成骨两种不同方式形成[16]。 既往研究通过在小鼠体内模型上特异性敲除SOX9 在颅神经嵴细胞的表达,发现锤骨、砧骨、Meckel 软骨等缺如,且下颌短小,提示软骨内成骨障碍[17]。 这一研究为后续阐明SOX9 在颅颌面发育中的调控作用,特别是对下颌骨等与软骨内成骨相关组织的发育调控作用提供了充分的基础。

目前已经阐明的SOX9 颅颌面特异性增强子包括 9CE4Z、F2、E3 等。Benko 等[18]在 2009 年发表的文章中研究了在SOX9 基因非编码区中可能蕴含的调控SOX9 于颅颌面组织中表达的元件,并在T3 转位区域上游以及F1 微缺失区段内, 分别鉴定出9CE4Z 和F2 两个顺式作用元件,进而在E9.5 小鼠胚胎中利用LacZ 验证其于下颌间充质的表达。 体外EMSA、ChIP 结果表明内源性Msx1 可结合到F2增强子上,而当其序列发生T>C 点突变时,则影响Msx1 同增强子的结合能力。 Msx1 是调控颅颌面骨组织发育的重要转录调控因子,其突变被报道同面裂相关[19-20]。 值得一提的是,后续研究表明F2 家系中T>C 的点突变遗传来自无PRS 表型的第1 代,而该家系中具有PRS 表型的患者除F2 点突变以外,同时亦含有FOXC2 基因的移码突变[21],提示F2增强子突变在PRS 发生机制中可能并非起到核心作用,SOX9 相关颅颌面表型可能与更多未知的增强子突变相关。

此外,通过比较人、小鼠等物种SOX9 区域基因序列的相似性,Bagheri-Fam 等[22]鉴定了若干SOX9颅颌面潜在增强子, 并在小鼠上通过LacZ 验证其组织特异性。 如SOX9 上游251 kb 的E3 增强子可介导LacZ 在E9.5 颅神经嵴细胞及内耳区域特异性表达,而SOX9 下游95 kb 的E7 增强子则调控报告基因在早期的端脑及中脑的表达。 另外,Gordon等[21]进一步发现了在E11.5 颅颌面组织中,SOX9 位点附近的若干潜在增强子,并在小鼠及斑马鱼模型中予以验证。 其中,mm 628、mm 634、mm 635 及mm 636 等增强子具有下颌、下唇、侧鼻突等组织特异性表达模式。

4 SOX9 性腺特异性增强子

在哺乳动物性别决定过程中,首先形成具有睾丸及卵巢双向分化潜能的性腺组织, 其中向睾丸方向分化由SRY 基因决定。 SRY 通过上调SOX9的表达以启动雄性性腺的发育[23-24]。 在小鼠睾丸组织中,SRY 协同 SF1 结合并激活 SOX9 上游 TES 增强子(Testic specific enhancer)以启动其表达[25-26]。 近期研究利用ATAC-seq 等技术鉴定了位于SOX9 转录起始位点上游565 kb 的Enh13 增强子。Enh13 增强子序列包含SRY 及SOX9 结合位点,敲除Enh13后可导致SOX9 mRNA 水平降低, 并可观察到XY性别反转的表型,验证了该增强子在小鼠睾丸发育中决定SOX9 表达的核心作用[27]。

除小鼠以外, 调控SOX9 在人性别决定的相关增强子也得到了阐明。 利用生物信息学方法,Croft等[28]对人基因组SOX9 上游调控序列进行了分析,筛选出3 个调控性腺发育的SOX9 增强子:eSR-A、eSR-B 及eALDI。这3 个增强子具有协同作用,能共同调控SOX9 在睾丸组织中的表达。 Croft 等认为在雄性性别发育过程中的前驱转录因子, 如SRY 和SF1,首先结合于eALDI 增强子上,启动SOX9 转录表达, 进而 eSR-A、eSR-B 及 eALDI 三者通过与SOX9 启动子区域形成染色质环,共同上调SOX9 表达水平。

综上所述,随着对基因表达调控和疾病研究的逐渐深入,越来越多的遗传性疾病被证明同基因的非编码区相关。 其中,增强子作为基因非编码区调控元件的代表, 可通过在空间上向启动子靠近,或通过转录非编码RNA 稳定染色质环结构, 发挥基因表达的调控作用, 是近年来的一大研究热点。SOX9 作为在软骨、性腺发育中的核心基因,其上下游非编码区域的异常可导致软骨发育不良、性别反转等表型,为研究基因非编码区异常的致病机制提供了良好的模型。 尽管SOX9 在软骨及性腺等组织表达的增强子已得到了初步发掘,但更为全面的增强子调控图谱还有待进一步揭示。 此外,这些不同增强子实现组织特异性调控SOX9 表达的机制还需深入研究。 随着全基因组测序技术和染色质构象捕获技术等的发展, 为鉴定更多SOX9 增强子提供了可能。另外,VISTA Enhancer Browser、ENdb database等增强子数据库的开发,为增强子的功能注释提供了可靠的信息来源[29-30]。

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