即墨黄酒陈化中几种营养物含量与褐变度的相关性

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(1.河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001；2.中央储备粮重庆直属库有限公司,重庆 400070；3.中粮君顶酒庄有限公司，山东 蓬莱 265600)

众所周知，黄酒是独具中国特色的一种酿造酒，营养丰富，被称为“液体蛋糕”[1-2]。黄酒颜色多呈褐色、黄色、棕色等，也有部分黄酒呈现无色的状态。通常传统工艺黄酒陈化时间长，色泽较深，而新工艺黄酒一般色泽较浅，后期需要添加焦糖色达到年份酒的要求。通常认为，黄酒色泽的产生与黄酒中存在丰富的糖类、氨基酸等有关系，两者的游离羰基与氨基能发生羰氨反应(又称美拉德反应)形成棕色缩合物，赋予黄酒一定的色泽。那么，黄酒中营养物组分与色泽形成存在怎样的关系，为什么酒龄越长色泽越深?惠明等[3]在前期发表的论文中以老户周黄酒(以糯米为主要原料)为例进行了相关研究，找到了一些规律。笔者以不同年份的即墨黄酒(以糜子为主要原料)为研究对象，通过测定还原糖、氨基酸、多酚、5-羟甲基糠醛(5-HMF)和抗坏血酸的含量等，采用SAS 9.1统计软件对即墨黄酒中主要营养物含量与褐变度的相关性进行分析，旨在探讨与黄酒陈化显著相关的褐变因子，为解析黄酒陈化中色泽形成机制提供理论依据，也为以后建立黄酒指纹图谱及有效地甄别酒龄提供参考，同时也对前期的研究结论进行验证。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验样品

即墨黄酒：1995，2000，2005，2010，2011，2012，2013，2014年份，由山东即墨黄酒厂提供，主要酿造原料为水、黍米和小麦。

1.1.2 试 剂

氰基硼氢化钠(NaBH3CN)、3-氨基-9乙基咔唑(AEC)，西亚试剂公司；福林酚试剂，上海生工SanGong Biotech公司；乙腈(色谱纯)，天津四友精细化学品公司；5-HMF、硫代巴比妥酸(TBA)，国药集团化学试剂有限公司；没食子酸，天津化学试剂三厂；2,6-二氯靛酚、草酸，上海阿拉丁试剂公司；葡萄糖、半乳糖、乳糖，天津科密欧化学试剂公司；麦芽糖，北京奥博星生物技术公司等。

1.1.3 主要仪器

723N型可见分光光度计，上海精科仪器有限公司；恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；S-433D自动氨基酸分析仪，德国Sykam公司；Agilent 1260 HPLC色谱仪，安捷伦科技有限公司等。

1.2 方 法

1.2.1 酒样中不同还原糖含量的测定

采用AEC柱前衍生及HPLC分离对即墨黄酒中的葡萄糖、麦芽糖、乳糖及半乳糖含量进行测定。衍生方法及HPLC的分析条件参照张英[4]的操作。

1.2.2 酒样中游离氨基酸含量的测定

采用氨基酸自动分析仪法[5]。

1.2.3 酒样中多酚含量的测定

采用Folin-Cioealteu法[6]。

1.2.4 酒样中5-羟甲基糠醛(5-HMF)的测定

采用Cohen等[7]的方法。

1.2.5 抗坏血酸的测定

采用2,6-二氯靛酚法[8]。

1.2.6 黄酒褐变度的测定

将即墨黄酒稀释20倍，分别测定其在420 nm处的吸光度，用褐变指数A420表示。由于黄酒的褐变度随时间变化而发生变化，因此在每一组分测定的同时，分别测定褐变度。

1.2.7 数据分析及处理

采用SAS 9.1分析软件对各测定因子与褐变度之间的相关性及其显著性进行分析，选择出与黄酒发生褐变有显著相关性的影响因子。

2 结果与分析

2.1 酒样中还原糖含量与黄酒褐变度的相关性

黄酒色泽的深浅与黄酒陈化中发生美拉德反应的程度直接相关，而还原糖是美拉德反应的重要底物之一。糖标准品及即墨黄酒的AEC柱前衍生HPLC色谱图如图1，2所示(由于同品牌不同年份黄酒所含糖的色谱图近似，这里仅以其中一个年份为例)，即墨黄酒中的糖成分主要为葡萄糖，其他糖的含量相对微量，所以后续以葡萄糖为对象分析还原糖与黄酒褐变的相关性及显著性。

图1 糖标准品的AEC柱前衍生HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram after precolumn

图2 2012年即墨黄酒中糖的AEC柱前衍生HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram after AEC precolumn derivatization for saccharides in Jimo rice wine made in 2012

不同年份即墨黄酒葡萄糖含量及其与褐变度的相关性和显著性如表1所示。

表1 不同年份即墨黄酒中葡萄糖含量与褐变度的相关性Table 1 Correlation between glucose content and browning degree in Jimo rice wine made in different years

①P<0.05为显著，P<0.01为极显著。

由表1可知：即墨黄酒中葡萄糖与褐变度的相关性极显著(P=0.003 6，P<0.01)，根据实验过程推测是由于葡萄糖在黄酒陈化中与氨基酸等氨基化合物发生美拉德反应，生成类黑精等褐色物质，从而对黄酒的褐变产生重要的影响。

2.2 酒样中游离氨基酸含量与黄酒褐变度的相关性

黄酒中氨基酸含量十分丰富，是饮料酒中氨基酸含量最高的酒种[9]，而氨基酸是美拉德反应的另一个重要底物，它还能与多酚及醌类物质络合，共同影响黄酒的陈化褐变[3]。即墨黄酒的氨基酸组分色谱图(同品牌不同年份的黄酒仅选取其中一个年份为例)如图3所示。不同年份即墨黄酒中游离氨基酸的含量如表2所示。游离氨基酸与褐变度的相关性及显著性如表3所示。

图3 2011年份即墨黄酒氨基酸组分测定色谱图Fig.3 Chromatograms of amino acid in Jimo rice wine made in 2011

表2 不同年份即墨黄酒中各游离氨基酸的含量Table 2 Amino acid contents in Jimo rice wine made in different years 单位：mg/L

表3 不同年份即墨黄酒中游离氨基酸与褐变度的相关性Table 3 Correlation between amino acid content and browning degree in Jimo rice wine made in different years

①P<0.05为显著，P<0.01为极显著。

由图3和表2，3可知：即墨黄酒(主要酿造原料为黍米和小麦)中，苏氨酸(Thr)、苯丙氨酸(Phe)与其褐变指数之间的相关性均显著(P<0.05)，亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)及精氨酸(Arg)与其褐变指数之间的相关性均极显著(P<0.01)。其余氨基酸与黄酒褐变度的相关性均不显著。

同老户周黄酒[3]相比，即墨黄酒酿造原料和工艺存在明显差异，与黄酒褐变度显著相关的氨基酸种类及含量也不完全相同，但两者中的Lys和Leu与褐变度的相关性均显著或极显著。原因可能是Lys含有两个氨基，更容易与羰基化合物发生美拉德反应，从而加速褐变，而Leu的疏水性较大，容易与多酚发生络合反应，这与梁靖等[10]的结论相一致，而氨基酸与多酚的交互作用也会对黄酒褐变产生显著影响。Thr与即墨黄酒褐变度的相关性显著，推测其具有较高的美拉德反应活性，这一结论与胡燕[11]模拟莲藕汁美拉德反应体系时发现苏氨酸具有很高的美拉德反应活性相一致。此外，与部分品牌黄酒褐变度相关性显著的Phe，Val，Ile及Ala也均属于疏水性氨基酸，容易与多酚发生络合而褐变。Arg的侧链含游离氨基，Asp含有两个羰基，所以推测两者均具有较高的羰氨反应活性，容易发生褐变。

2.3 酒样中多酚含量与黄酒褐变度的相关性

不同年份即墨黄酒中的多酚含量及其与褐变度的相关性和差异显著性如表4所示。

表4 不同年份即墨黄酒中多酚含量与褐变度的相关性Table 4 Correlation between polyphenol content and browning degree in Jimo rice wine made in different years

①P<0.05为显著，P<0.01为极显著。

由表4可知：即墨黄酒中的多酚含量与其褐变度之间的相关性极显著(P<0.01)。多酚在O2的作用下，容易发生氧化聚合，生成醌类物质，醌类物质随后可通过聚合反应形成大分子有色物质。醌类物质可与酚类、胺类等亲核物质相结合，反应产生的二聚体或多聚体有可能发生结构重排而生成新的二酚二聚体，从而更容易被氧化，然后进入下一轮循环，产生褐色的多聚体，从而加速褐变[3]。

2.4 酒样中5-羟甲基糠醛(5-HMF)含量与黄酒褐变度的相关性

不同年份即墨黄酒中的5-羟甲基糠醛含量与黄酒褐变度的相关性如表5所示。

表5 不同年份即墨黄酒中5-HMF含量与褐变度的相关性Table 5 Correlation between 5-HMF content and browning degree in Jimo rice wine made in different years

①P<0.05为显著，P<0.01为极显著。

由表5可知：两者相关性显著(P<0.05)。5-羟甲基糠醛是酸性条件下美拉德反应的重要中间产物，可进一步反应生成类黑精，从而引起褐变[12,15]。同时，在黄酒的陈化过程中，5-羟甲基糠醛也是抗坏血酸氧化分解的中间产物，是褐变程度的重要表征因子之一[13]。

2.5 抗坏血酸与黄酒褐变度的相关性

抗坏血酸在黄酒中有少量存在，氧化分解后可与游离氨基酸发生美拉德反应而引起褐变[14]。不同年份即墨黄酒中的抗坏血酸含量及其与褐变度的相关性如表6所示。

表6 不同年份即墨黄酒中抗坏血酸含量与褐变度的相关性Table 6 Correlation between ascorbic acid content and browning degree in Jimo rice wine made in different years

①P<0.05为显著，P<0.01为极显著。

由表6可知：两者之间的相关性并不显著(P>0.05)。原因可能是，与多酚引起的褐变效果相比，抗坏血酸引起的褐变反应速度较慢，并且其在黄酒中的含量相对较低，对黄酒褐变的影响较小，所以两者的相关性并不显著。

3 结 论

即墨黄酒在陈化中色泽会逐步加深，这是黄酒后熟的一个重要标志。黄酒中易发生褐变的营养物含量与褐变度存在一定的相关性，主要表现在：即墨黄酒中主要的糖为葡萄糖，其他糖的含量相对较少，葡萄糖与褐变度的相关性极显著；黄酒中的Thr，Phe与其褐变度的相关性显著，Leu，Lys及Arg与其褐变度的相关性极显著，其余氨基酸与黄酒褐变度的相关性不显著；酒样中的多酚和5-HMF含量与黄酒褐变度之间的相关性分别为极显著和显著。黄酒中含有微量抗坏血酸，其与黄酒褐变度之间的相关性不显著。以上结果为进一步分析即墨黄酒色泽的形成机制和建立产品指纹图谱提供了参考。