一株具有抑菌活性的平榛内生真菌的鉴定

周永强，余佳佳，孔德静，胡娟，陈群英，赵春丽，周英*

(1.贵州中医药大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学 实验中心，贵州 贵阳 550025)

植物内生真菌是指在植物的组织中以细胞内或细胞间的方式生长，而不会对它们造成任何有害影响的微生物[1]。由于内生真菌长期和宿主植物生活在一起并建立了特殊互相促进生长的关系，内生真菌可以合成如萜类、生物碱类及芳香族类等抗菌物质[2～4]。这些代谢产物种类丰富且多具有生物活性，如抗肿瘤、抑菌及抗氧化等[5～8]。此外，内生真菌因具有生长周期短、易培养、条件易控制等特点，使得利用内生真菌发酵获得具有活性的抑菌成分成为可能。

榛(CorylusheterophylaFisch.ex Bess)，为桦木科(betulaceae)，榛属(corlus L.)植物。目前国内外学者已从榛树植物中分离的到了多种有效成分，诸如β-谷甾醇类、鞣质类、麦角甾醇类、黄酮类、及(口山)酮类(xanthone)化学成分[9]。榛树中的这些化学成分多具有不同的生物活性，研究表明，榛树中的鞣质类成分具有对DPPH自由基清除能力，榛树中黄酮类、苯骈色原酮类化合物多具有心血管保护作用、抗菌等活性，此外，有学者在榛树中发现了具有抗肿瘤活性的紫杉醇类成分[9～11]。因此，榛属植物有望成为提取紫杉醇原料药的新植物资源。研究表明，药用植物内生真菌能产生与宿主相同的药效成分，且许多高等植物所产生的具有新生物活性的化合物与其内生菌有关[12]。然而，目前有关榛树内生真菌的研究尚无报道，本文拟对课题组前期分离的一株内生真菌进行形态学和分子鉴定，并对该菌株发酵后进行体外抑菌活性的筛选，为扩大榛树中抑菌成分的研究提供新的思路和途径。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

平榛内生真菌菌株zs-14由课题组从平榛的茎条中分离得到，经纯化后，保存于贵州中医药大学药学院生物制药实验室。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)及白色念珠菌(Moniliaalbican)均为本实验室保存。

1.2 供试培养基

内生真菌zs-14的形态学观察培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌的培养采用LB固体培养基，白色念珠菌的培养采用马丁培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 内生真菌zs-14的形态学鉴定

在无菌条件下，挑取保存在PDA斜面培养基上的内生真菌菌丝或孢子，接种于插有灭菌过的盖玻片的PDA培养基的交叉线处培养，于28 ℃的培养箱中恒温培养5 d。待菌丝长到盖玻片上时将玻片取下，放置酒精擦拭过的载玻片上，用乳酸酚-棉兰染液固定0.5 h，用无菌水反复冲洗多余染液，随后在光学显微镜下观察内生真菌的微观形态特征，对照《真菌鉴定手册》进行形态学鉴定[13]。

1.3.2 内生真菌zs-14的分子鉴定

用接种针挑取保存在PDA斜面培养基的内生真菌的菌丝，转接于100 mL的PDB发酵培养基中，28 ℃黑暗条件，160 r·min-1摇床培养3～5 d。用8层无菌纱布过滤发酵液，得到菌丝，用液氮研磨法提取内生真菌基因组DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测真菌基因组DNA提取结果，并采用真菌的特异性鉴定引物V9D(5’-TTAAGTCCCTGCCCTTTGTA-3’)、LS266(5’-GCATTCCCAAACAACTCGACTC-3’)对内生真菌进行ITS (Internal Transcribed Spacer)序列扩增。扩增反应体系50 μL：模板DNA：1 μL，Taq DNA聚合酶(50 U·μL-1)：0.35 μL，10×PCR Buffer：7 μL，dNTP (2.5 mM)：4 μL，引物V9D(10 μM)：2 μL，引物LS266(10 μM)：2 μL，灭菌去离子水：33.65 μL。扩增结束后，取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证目的条带，进一步将扩增出未纯化的PCR产物进行测序。最后将所得序列结果与GenBank中已知序列进行blast分析，应用MEGA5.05软件对比分析并构建系统进化树。

1.3.3 内生真菌zs-14发酵液抑菌活性检测

收集培养10 d的100 mL榛树内生真菌发酵培养物，用布氏漏斗将菌体与发酵液分开。然后无菌条件下取20 mL发酵液用0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液备用。另外，将抽滤后的发酵液依次用石油醚、乙酸乙酯及水饱和正丁醇进行萃取，回收溶剂的相应萃取物，备用。

将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌菌株活化后分别接种到LB液体培养基中，37 ℃、150 r·min-1震荡培养箱中培养24 h后，移液枪吸取200 μL菌液分别涂布于LB琼脂平板。将白色念珠菌接种到马丁液体培养基，28 ℃、150 r·min-1震荡培养箱中培养24 h后，移液枪吸取200 μL菌液涂布于马丁琼脂平板。然后无菌条件分别吸取已过滤处理的50 μL的内生真菌滤液、25 g·L-1的石油醚、乙酸乙酯及水饱和正丁醇的萃取物于无菌空白药敏纸片(直径5 mm)上，用无菌镊子夹取贴于带菌平板表面，同以浸润有青霉素钠溶液(100U·片-1)的滤纸片作为阳性对照，不含药液的滤纸片作为阴性对照。细菌、真菌分别37 ℃、28 ℃培养48 h后观察其对供试菌株的抑制作用，用抑菌圈测量仪测量抑菌圈半径大小。

2 结果与分析

2.1 平榛内生真菌zs-14形态学鉴定

zs-14的菌丝在PDA平板刚萌发时成白色绒毛状，菌落形成时，则变为黄色边缘及顶部间有白色绒毛状，菌落薄，皱缩，呈放射状生长，无渗出液。插片培养5 d后，取下盖玻片，经乳酸-棉兰染液染色观察，发现显微镜下菌丝呈成网状发散状分布，分生孢子呈球形状，根据其形态学特征将zs-14鉴定为Phomasp.(茎点霉属)(图1)。

A.菌落形态B.孢子形态C.菌丝形态D.液体发酵 A. Colony B. Spore C. Mycelium D. Fermentation图1 内生真菌zs-14的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of endophytic fungi zs-14

2.2 平榛内生真菌zs-14分子鉴定

液氮研磨法提取内生真菌zs-14的DNA结果经琼脂糖凝胶电泳显示，其基因组分子量大小在20 kbp左右，且条带清晰，符合作为PCR扩增的模板(图2)。

Marker：分子量标记，ck：阴性对照，zs-14：基因组DNA图2 内生真菌zs-14的基因组DNA电泳图Fig.2 Genomic DNA electrophoresis of endophytic fungi zs-14

zs-14的ITS区经引物V9D和LS266扩增后，经琼脂糖凝胶电泳验证，结果显示，PCR扩增产物在1 000 bp左右出现特异性条带(图3)，PCR产物经测序得到898 bp的DNA序列。

Marker：分子量标记，ck：阴性对照，zs-14：扩增产物图3 内生真菌zs-14的PCR扩增产物电泳图Fig.3 Electrophoresis of PCR amplified products of endophytic fungi zs-14

将测得内生真菌zs-14的扩增产物序列，直接通过NCBI中的Blast进行序列比对，比对后，选取与内生真菌zs-14最相近的序列，并用MEGA 5.05软件构建系统进化树。结果显示，在进化树中，内生真菌zs-14与KF367493聚类在同一分支，亲缘关系表现为最为相近，且同源性达到99%(图4)。同时，结合zs-14的形态学特征，最终将该菌株鉴定为Phomasp.(茎点霉属)。

2.3 平榛内生真菌zs-14的抑菌活性

纸片扩散法检测内生真菌zs-14的发酵液、石油醚、乙酸乙酯及水饱和正丁醇的萃取部位对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及白色念珠菌的抑菌活性，结果如图5所示。

结果显示，zs-14的发酵液只针对金黄色葡萄球菌有抑制作用，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及白色念珠菌无明显抑制作用(表1)。

图4 内生真菌ZS-14的ITS系统进化树Fig.4 ITS phylogenetic tree of endophytic fungi zs-14

A.zs-14正丁醇萃取物B.青霉素对照C.阴性对照D.zs-14发酵液A. N-butanol extract of zs-14 B. Penicillin control C. Negative control D. Fermentation broth of zs-14图5 内生真菌zs-14对金黄色葡萄球菌的抑制活性Fig.5 Inhibitory activity of endophytic fungi zs-14 against Staphylococcus aureus

进一步研究发现，zs-14的发酵液的正丁醇萃取部位对金黄色葡萄球菌有明显抑制作用，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及白色念珠菌无明显抑制作用，而石油醚和乙酸乙酯萃取部位则无抑菌作用(表1)。

表1内生真菌zs-14对不同供试菌株的抑菌圈半径/mm

Table1 Radius of bacteriostatic zone of endophytic fungi zs-14 for different tested strains

菌株Strain发酵液Fermentation broth石油醚Petroleum ether乙酸乙酯Ethyl acetate正丁醇N-butanol青霉素Penicillin大肠杆菌----5.1金黄色葡萄球菌1.0--2.06.2枯草芽孢杆菌----4.7白色念珠菌-----

注：“-”为无抑菌效果。

Note：“-” represented no antiseptic effect.

3 讨论与结论

研究表明，大多药用植物内生真菌产生的次级代谢产物具有抑菌的活性。近年来有关筛选抑菌活性的内生真菌的报道逐渐增多。杜晓娜等[14]从南海指海绵上的共附生真菌中筛选得到3种(6株)对金黄色葡萄球菌有抑菌活性的真菌菌株，赵名君等[15]从叶底珠中分离得到41株内生真菌，其中，筛选出两株具有较强抑制白色念珠菌的活性，金宏杰[16]等从龙脑樟树叶中分离得到的39株内生真菌中筛选出7株具有对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌较强抑制活性的菌株。可见，通过研究植物内生真菌抑菌活性为抑菌药物的研发开辟了新的路径。

本研究首次从榛树茎条中分离得到内生真菌zs-14，并采用形态学及分子鉴定方法将其鉴定为Phomasp(茎点霉菌)。研究报道，茎点霉菌可被作为防治双子叶杂草的微生物除剂，对车前、车轴草和鸡眼草表现较为敏感[17]。此外，Palak等从洋甘草中分离得到的Phomasp.(茎点霉菌)能够产生抑制金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌生长的生物碱成分Thiodiketopiperazine[18]。作为本研究从榛树茎条中分离得到的Phomasp.(zs-14)同样具有抑菌活性，且具有选择性，只针对金黄色葡萄球菌表现为抑制活性，抑菌圈半径为1.0 mm，进一步筛选确定了zs-14的抑菌有效部位为发酵液的正丁醇萃取部位，抑菌圈半径为2.0 mm。另有研究学者相继从尖瓣海莲叶内生真菌Penicilliumsp. B21发酵液中获得挥发油成分，并发现挥发油在20 mg·L-1时，对大肠埃希菌和白色葡萄球菌表现为良好抑菌活性[19]，从紫苏内生真菌Penicilliumsp. 12Y25的发酵产物的乙酸乙酯提取物中发现麦角甾醇类成分对番茄灰霉菌和西瓜枯萎菌表现为中等强度的抑制活性[20]。

总之，榛树茎中存在内生真菌，且经分离鉴定得到的内生真菌的发酵液具有抑制金黄色葡萄球菌生长的活性。下一步，将针对zs-14抑制金黄色葡萄球菌生长的有效部位进行深入的成分分离鉴定研究，从而从榛树内生真菌zs-14中筛选出具有抑制金黄色葡萄球菌活性的单体化合物。