复合酶制剂及植物精油对感染产气荚膜梭菌肉仔鸡抗氧化及免疫指标的影响

孙秋娟，安然，呙于明*

(1.北京市华都峪口禽业有限责任公司，北京 101206；2.中国农业大学 动物科技学院，北京 100193)

坏死性肠炎为目前全球普遍高发的一种禽病，对经济及动物福利的影响巨大。在欧盟抗生素禁用及配方中动物副产品使用受限的情况下，坏死性肠炎尤为严重[1]。A型或C型产气荚膜梭菌繁殖产生的细菌外毒素是引起坏死性肠炎的主要因素[2]。Qiujuan Sun等研究表明，酶制剂和植物精油的添加可提高产气荚膜梭菌感染肉鸡的生长性状，并可降低回肠有害菌的定殖，保护肠道屏障功能及组织形态结构免受产气荚膜梭菌感染的侵害，从而维持肠道健康[3]。蛋白酶也被证明可缓解坏死性肠炎造成的损失[4]。抗氧化力及免疫力对于维持机体健康状况至关重要。Lee等采用胚胎注射硒的方式，验证硒对于产气荚膜梭菌感染的肉仔鸡的抗氧化力及免疫力等有保护作用[5]。本试验旨在验证酶制剂及植物精油对机体抗氧化力及免疫力的影响。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用植物精油及复合酶制剂均购自Novus Intl. Inc.。植物精油(EO)中含麝香草酚25%、香芹酚25%、二氧化硅37%、单甘油酯及双甘油酯13%；复合酶制剂(CSM)中含木聚糖酶2 424 000 IU·kg-1、葡聚糖酶506 600 IU·kg-1及甘露聚糖酶322 800 IU·kg-1。

1.2 试验方法

试验选用648只Cobb 500雌性肉仔鸡作为试验对象，随机分为8个处理(每个处理9个重复，每个重复9只鸡)。选用小麦-豆粕型日粮，采用2×2×2因子设计，研究植物精油(EO：0、60 mg·kg-1)、复合酶制剂(CSM：0、500 mg·kg-1)、细菌感染(产气荚膜梭菌：感染、未感染)及其交互作用对肉鸡肠道健康的影响。试验处理见表1。日粮配制参照NRC(1 994)，基础日粮组成见表2，日粮营养指标实测值见表3。试验自肉仔鸡0日龄至35日龄，自由采食、饮水。日常管理按常规程序进行。

表1 试验处理Table 1 Experiment design

注：产气荚膜梭菌感染(“+”为感染；“-”为未感染)。

Note：ClostridiumPerfringensChallenge: “+” means challenged, “-” means with no challenge.

产气荚膜梭菌感染模型采用刘丹[6]修改过的Dahiya[7]建立的试验方法。人工感染选用鸡源A型产气荚膜梭菌(CVCC52)，菌种购自国家兽医微生物菌种保藏中心。仔鸡第14至20日龄时，处理1至4的肉鸡每日进行嗉囊接种1 mL A型产气荚膜梭菌菌液(2×108菌·mL-1)，处理5至8则每日接种1 mL相同的无菌培养基[3]。

21、28日龄时，每处理随机选取6只仔鸡屠宰取样。分离血清、血浆，-30 ℃保存以备血液生化指标测定。血清IFNγ、IL-1β及IL-10浓度均采用ELISA试剂盒(Cusabio Biotech)进行测定。血浆谷胱甘肽过氧化物酶活性及血清尿酸水平采用南京建成的试剂盒进行测定。

表2 试验基础日粮配方Table 2 Composition of basal diet

注：1每千克日粮中微量元素含量为：铜8 mg，锌75 mg，铁80 mg，锰100 mg，硒0.15 mg，碘0.35 mg。2每千克日粮中维生素含量为：VA，12 500 IU；VD3，2 500 IU；VK3，2.65 mg；VB1，2 mg；VB2，6 mg；VB12，0.025 mg；VE，30 IU；生物素，0.032 5 mg；叶酸，1.25 mg；泛酸，12 mg；尼克酸，50 mg。

Note：1Trace mineral premix provided the following (per kg of diet): copper, 8 mg; zinc, 75 mg; iron, 80 mg; manganese, 100 mg; selenium, 0.15 mg; iodine, 0.35 mg.2Vitamin premix provided the following (per kg of diet): vitamin A, 12 500 IU; vitaminD3, 2 500 IU; vitamin K3, 2.65 mg; vitamin B1, 2 mg; vitamin B2, 6 mg; vitaminB12, 0.025 mg; vitamin E, 30 IU; biotin, 0.032 5 mg; folic acid, 1.25 mg; pantothenic acid, 12 mg; niacin, 50 mg.

1.3 统计分析

数据采用SPSS 16.0软件中GLM过程进行统计分析，剖析植物精油EO、复合酶制剂CSM、产气荚膜梭菌感染及其相关关系的影响。交互作用显著时，采用One-way ANOVA进行分析，处理间差异采用Duncan多重比较进行检验，并编程剖析产生交互作用的原因。P<0.05时认为差异显著。

2 试验结果

2.1 血清细胞因子

血清细胞因子测定结果见表3。肉仔鸡感染产气荚膜梭菌未对IL-10浓度产生影响(P>0.10)，但显著提高28日龄IL-1β水平(P<0.01)。日粮中CSM的添加显著提高21日龄时血清IL-1β、IL-10(P< 0.05，P< 0.05)，但降低28日龄时IL-1β水平(P<0.01)。日粮中添加EO有提高21日龄IL-10的趋势(P=0.061)。28日龄时血清IFNγ存在EO及CSM的交互作用(P=0.053)：与未添加EO及CSM的日粮(28.16)相比，日粮中CSM的添加显著提高28日龄血清IFNγ水平(-EO、+CSM：43.98；+EO、+CSM：36.83)。而28日龄血清IL-10则表现出细菌感染、EO及CSM之间的交互作用(P<0.01)：未感染产气荚膜梭菌肉仔鸡采食基础日粮28日龄时具有较高的血清IL-10水平；而感染产气荚膜梭菌后，CSM处理组血清IL-10水平最高。

表3 植物精油及复合酶制剂对感染产气荚膜梭菌肉鸡血清细胞因子的影响Table 3 Effects of essential oil and feed enzymes on serum cytokines concentration of C. perfringens challenged chicks

注:同行不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：Different letters show significant difference at the 0.05 level in the same array.

2.2 血清抗氧化指标

血清尿酸及谷胱甘肽过氧化物酶的测定结果见表4。肉仔鸡产气荚膜梭菌感染，显著提高21日龄时血清尿酸水平(P<0.01)。日粮中CSM的添加显著提高28日龄时血清尿酸浓度(P<0.05)。21日龄时血清谷胱甘肽过氧化物酶活性存在产气荚膜梭菌感染及EO之间的交互作用(P<0.05)：饲喂添加EO日粮的肉仔鸡在产气荚膜梭菌感染后血清谷胱甘肽过氧化物酶活性显著提高(+EO、未感染：771.7，+EO、感染后：887.1)。28日龄时血清谷胱甘肽过氧化物酶活性则表现出产气荚膜梭菌感染及CSM之间的交互作用(P< 0.05)：日粮中CSM的添加可缓解产气荚膜梭菌感染导致的谷胱甘肽过氧化物酶活性的降低。

表4 植物精油及复合酶制剂对感染产气荚膜梭菌肉鸡血清抗氧化指标的影响Table 4 Effects of essential oil and feed enzymes on serum antioxidant capacity of C. perfringens challenged chicks

注:同行不同字母表示差异显著(P<0.05)

Note：Different letters show significant difference at the 0.05 level in the same array.

3 讨论

3.1 免疫功能

试验自14日龄开始产气荚膜梭菌攻毒，并持续至20日龄。产气荚膜梭菌感染可引发机体产生炎症反应，释放炎性因子。本试验结果显示，产气荚膜梭菌感染早期血清炎性因子IFNγ、IL-1β及抗炎性因子IL-10的水平与健康组无显著差异，而感染后期血清IL-1β浓度显著高于健康肉鸡。炎性因子IL-1β被证明可诱发发热反应，激活细胞因子网络[8]。感染沙门氏菌肉鸡，IL-1β的基因表达水平的上调一般发生在感染1～6周后[9, 10]。28日龄感染产气荚膜梭菌的仔鸡血清IL-1β水平高于健康组，可证实其机体存在炎症反应、模型建立成功。

IL-10为抗炎性因子，在体内可抑制IL-1β、IL-6等炎性因子的产生[11]，并可抑制T细胞、单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞的激活和功能[12]。而本日粮中添加CSM和EO可提高21日龄IL-10的浓度，意味着CSM和EO可更好的调动机体抗炎性反应。而日粮CSM的添加可降低28日龄IL-1β、提高IL-10水平，也可以验证CSM的添加可以降低机体的炎症反应，并具有更好的抵抗炎症反应的能力。

3.2 抗氧化功能

本试验结果显示，产气荚膜梭菌感染可显著提高机体尿酸水平。尿酸为禽类蛋白质代谢的产物，在机体内可清除血浆中2/3的自由基[13]。产气荚膜梭菌感染引发机体的炎症反应，并由此导致机体产生氧化应激。而血清尿酸水平的增加可以抵抗由于细菌感染造成的氧化应激状态。谷胱甘肽过氧化物酶为体内抗氧化防御系统第一道防线中的一种重要的抗氧化酶[14]，可减少过氧化氢的产生。日粮中EO的添加可以提高产气荚膜梭菌感染肉仔鸡21日龄时血清谷胱甘肽过氧化物酶活性，而CSM可提高28日龄血清谷胱甘肽过氧化物酶活性，从而有利于机体自氧化应激状态的恢复。

4 结论

本研究结果显示，植物精油EO及复合酶制剂CSM在肉鸡日粮中应用可提高产气荚膜梭菌感染肉鸡抵抗炎症反应的能力及抗氧化力，从而有利于机体疾病情况下的恢复。未来可就植物精油及复合酶制剂的抗炎反应及抗氧化功能的影响机制进行进一步研究。