环状RNA hsa_circ_104871在系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中的表达和意义

黄自坤，张 露，曾璐璐，罗 清

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种病因不明的,以免疫性炎症为突出表现的系统性自身免疫病，好发于育龄期妇女[1]。目前用于诊断的实验室指标主要为自身抗体，但是自身抗体敏感性较低，患者中阳性率也较低，有一定的误诊和漏诊[2-3]。环状RNA是最近新发现的区别于传统线性RNA的一类特殊RNA，主要由mRNA前体通过可变剪切加工产生，具有闭合环状结构[4]。此外，这使得环状RNA在作为新型临床生物标记物的开发应用上具有明显优势。环状RNA在多种疾病[5-7]的诊断、疗效判断、监测复发上的作用已得到证实，在SLE中的作用也逐渐得到大家的认识[8]。该研究首次以外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)环状RNA hsa_circ_104871为研究目标，探讨其在SLE诊断和鉴别诊断中的价值和意义。

1 材料与方法

1.1 病例资料70例SLE患者来自南昌大学第一附属院风湿免疫科2017年1月～2019年3月期间住院患者，其中男5例，女65例；年龄11～75(40.8±14.6)岁，临床诊断符合美国风湿病学会(ACR)1997年修订的分类标准[9]，并排除严重糖尿病、高血压、高血脂、心脑血管疾病、肝肾疾病、血栓性疾病、血小板疾病等其他疾病。健康对照组70例，均为健康志愿者，排除炎症或其他自身免疫性疾病，其中男10例，女70例；年龄22～74(38.4±11.3)岁。两组性别、年龄无显著性差异。详细收集SLE患者临床资料及相关实验室检查数据，并计算其SLE疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)[10]。此外，选取同期收治的76例类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)作为RA疾病对照组，其中男14例，女62例；年龄16～79(54.9±12.3)岁。临床诊断符合美国风湿病学会(ACR)1987年修订RA诊断标准[11],并排除其他疾病。本实验经过医院伦理委员会批准，患者和健康人均签署知情同意书。

1.2 试剂和主要仪器Ficoll分离液购自美国Sigma公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；去除DNA的PrimeScriptTM逆转录试剂盒和SYBR ® Premix Ex Taq TM购自大连宝生物TaKaRa公司；hsa_circ_104871及内参基因β-actin引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Nanodrop ND-1000 紫外分光光度计购自美国Nanodrop公司；Applied Biosystems 7500型荧光定量PCR仪器购自美国ABI公司。

1.3 PBMC提取采集受试者清晨空腹EDTA抗凝外周血2 ml，6 h内送检。采用Ficoll分离液分离PBMC，用TRIzol试剂处理，放-80 ℃冰箱保存。

1.4 PBMC总RNA提取按TRIzol试剂说明书分别提取SLE组患者、RA疾病对照组和健康对照组PBMC中的总RNA,焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的蒸馏水溶解 RNA,采用RNA纯化试剂盒纯化总RNA。进一步使用Nanodrop ND-1000紫外分光光度计对总RNA进行定量和质量分析。

1.5 RT-PCR检测采用RT-PCR SYBR Green法，以β-actin作为内参进行hsa_circ_104871的检测。提取PBMC中的总RNA，DEPC水溶解后，取 1 μl RNA，利用 PrimeScript反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。采用20 μl反应体系进行检测，PCR引物序列见表1。反应体系包括：1 μl反转录产物、0.5 μmol/ L上游引物、0.5 μmol/L下游引物、1×SYBR荧光染料试剂。PCR反应条件为：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，72 ℃、30 s，40个扩增循环。所有样品做3个复孔。RT-PCR使用ABI7500仪器进行。分析待测标本的扩增熔解曲线，均为单峰，无非特异性扩增。根据待测标本的Ct值，采用相对定量法对RT-PCR结果进行分析，计算2-ΔCt。引物序列见表1。

表1 荧光定量 PCR 引物序列

1.6 SLE相关的其他指标检测方法IgG、C3、C4、CRP采用速率散色比浊法(试剂和仪器购自美国Beckman Coulter公司)；抗ds-DNA采用酶联免疫吸附法(试剂购自上海科新生物技术股份有限公司)；抗ENA抗体采用免疫印记法检测(试剂和仪器均购自德国欧蒙公司)；ESR采用动态血沉仪法(仪器购自北京普利生公司)；血常规采用电阻抗法(试剂和仪器购自日本希森美康公司)。

1.7 统计学处理采用SPSS 17.0软件进行分析，实验数据首先进行正态性检验，符合正态分布数据，两组样本均数的比较采用t检验，否则采用非参数检验。两个变量之间相关性采用Pearson相关分析。受试者工作特征(receiver operator characteristic, ROC)曲线分析评价circRNA诊断和鉴别诊断的敏感性和特异性。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLE组患者和健康对照组PBMC中环状RNA hsa_circ_104871中表达的比较SLE组患者PBMC中环状RNA hsa_circ_104871表达水平显著低于健康对照组，分别为(0.000 72±0.000 73)和(0.001 17±0.000 75)，差异有统计学意义(t=3.57，P=0.000 5)。见图1。

图1 SLE组患者和健康对照组 PBMC中环状RNA hsa_circ_104871表达与健康对照组比较：***P<0.001

2.2 SLE组患者和RA疾病对照组PBMC中环状RNA hsa_circ_104871表达的比较SLE组患者PBMC中环状RNA hsa_circ_104871表达水平显著低于RA疾病对照组，分别为0.000 52(0.000 29，0.000 81)和0.000 95(0.000 58，0.001 45)，差异有统计学意义(U=1 472，P<0.000 1)。见图2。

2.3 SLE组患者和对照组(健康对照者+RA疾病对照者)PBMC中环状RNA hsa_circ_104871表达的比较SLE患者PBMC中环状RNA hsa_circ_104871表达水平显著低于对照组，分别为0.000 52(0.000 29，0.000 81)和0.000 90(0.000 63，0.001 45)，差异有统计学意义(U=2 654，P<0.000 1)。见图3。

图2 SLE组患者和RA疾病对照组 PBMC中环状RNA hsa_circ_104871表达与RA疾病对照组比较：***P<0.001

图3 SLE组患者和对照组PBMC中 环状RNA hsa_circ_104871表达与对照组比较：***P<0.001

2.4 PBMC中环状RNA hsa_circ_104871表达水平与SLE患者临床参数之间相关性分析SLE患者PBMC环状RNA hsa_circ_104871表达水平与PLT呈正相关(r=0.290 0，P=0.015 7)(图4)，而与其他临床指标(SLEDAI，ESR，C3，C4，自身抗体等)不相关。

2.5 PBMC中环状RNA hsa_circ_104871对SLE诊断的价值为评估PBMC中环状RNA hsa_circ_104871对SLE的诊断价值，对SLE患者和健康对照者的PBMC中环状RNA hsa_circ_104871表达水平进行ROC曲线分析，ROC曲线AUC为0.759(95%CI:0.677～0.841;P<0.000 1)，Cut-off值为0.000 620 2，敏感性为64.29%，特异性为81.43%，阳性预测值为66.18%，阴性预测值为72.83%，约登指数为0.457。见图5。

图4 SLE组患者PBMC中环状 RNA hsa_circ_104871表达水平与PLT的相关性分析

图5 SLE组患者与健康对照组PBMC中环状 RNA hsa_circ_104871的ROC曲线分析

2.6 PBMC中环状RNA hsa_circ_104871对SLE与RA鉴别诊断的价值对SLE组与RA疾病对照组PBMC中环状RNA hsa_circ_104871的表达水平进行ROC分析，AUC为0.727(95%CI: 0.645～0.809;P<0.000 1)，Cut-off值为0.000 697 8，敏感性为70.00%，特异性为66.23%，阳性预测值为65.33%，阴性预测值为70.83%，约登指数为0.362；对SLE与对照组PBMC中环状RNA hsa_circ_104871的表达水平进行ROC分析，AUC为0.742(95%CI:0.666～0.818;P<0.000 1)，Cut-off值为0.000 628 9，敏感性为65.71%，特异性为74.80%，阳性预测值为54.76%，阴性预测值为82.48%，约登指数为0.405。见图6。

3 讨论

目前，SLE诊断的必要条件是抗核抗体谱，包括抗双链DNA抗体、抗核抗体、抗可提取性核抗原抗体等，其中抗双链DNA抗体(anti-dsDNA)、抗史密斯抗体(anti-Sm)和抗核小体抗体是SLE的标志性抗体[2-3，12]，对于SLE的诊断具有很好的特异性。但这些指标诊断SLE的敏感性都不理想，其中抗核小体抗体的敏感性最强，但也只有约60%，anti-dsDNA的敏感性低于50%，而anti-Sm抗体的敏感性只有10%～30%[2，12]。因此，临床上目前仍缺乏理想的SLE诊断标志物。

图6 SLE组患者分别与RA疾病对照组和对照组 PBMC中环状RNA hsa_circ_104871的ROC曲线分析

A：RA疾病对照组；B：对照组(健康对照者+RA疾病对照者)

研究[13]表明，环状RNA在血液中可长期稳定存在，RNA酶降解作用、煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等各种处理方法均不会造成血液环状RNA的损失，比较适宜作为基本的临床诊断标志物。近期，国内外均有学者尝试探讨环状RNA作为自身免疫性疾病诊断标志物的可行性，并取得了可喜的成果[6-7，14]。此外，Li et al[8]采用高通量基因芯片检测发现SLE患者血浆环状RNA表达谱发生显著变化，表明环状RNA可作为SLE的潜在诊断标志物。

关于环状RNA hsa_circ_104871是否可作为SLE潜在的诊断标志物，本研究结果显示SLE组患者PBMC中hsa_circ_104871表达水平降低，进一步分析SLE组PBMC中hsa_circ_104871表达的临床意义，结果显示其表达水平与SLE患者的PLT数量呈正相关，说明hsa_circ_104871表达水平与疾病严重程度呈反比，患者疾病越严重，hsa_circ_104871分子的表达水平越低。另外，ROC曲线分析表明，hsa_circ_104871可有效地从健康对照者中诊断出SLE患者，其敏感性为64.29%，而特异性可达到81.43%。

SLE可累及关节，患者经常会有关节疼痛等症状，临床上容易与RA混淆，为此该文比较了SLE患者与RA患者PBMC中hsa_circ_104871的表达水平，SLE患者PBMC中hsa_circ_104871表达水平显著低于RA疾病对照组，差异有统计学意义。进一步的ROC曲线分析证实其可有效将SLE患者与RA患者区别开来，可用于SLE与RA的鉴别诊断。此外，本研究还显示RA患者的PBMC中hsa_circ_104871表达水平与健康对照者无差异，这与Ouyang et al[6]研究结果不一致，Ouyang et al[6]研究分析了30例健康对照者和35例初诊的RA患者PBMC中hsa_circ_104871表达水平，结果表明RA患者PBMC中的hsa_circ_104871表达水平明显高于健康对照者，但也未显示RA患者PBMC中的hsa_circ_104871表达水平与疾病活动度等临床指标相关，ROC曲线分析表明RA患者PBMC的hsa_circ_104871表达水平对RA的诊断效能较好，敏感性为83.30%，特异性为68.00%。这其中的差异可能源自：① 不同 RA 患者异质性较大；② 本文收集的RA病例并非均是初诊未治疗的，药物可能对其表达有影响；③ 自身免疫性疾病发病机制较复杂。

本研究尚存在一些不足：① SLE患者的研究样本不够多；② 没有检测治疗前后以及初诊和复诊患者之间hsa_circ_104871的表达差异，无法明确其在预后监测中的疗效。在后续的研究中将进一步扩大样本量检测SLE患者PBMC hsa_circ_104871的表达，使研究结果更具有可靠性。