褪黑素对肝星状细胞中PI3K/AKT信号通路的影响

陈艳梅，洪汝涛，岳彩飞

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF) 是多种致病因素长期刺激肝脏引起的代偿反应，其病理特征是肝内细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积，最终进展为肝硬化、肝癌[1]。目前尚无有效治疗肝纤维化的药物。研究[2]证实，肝纤维化可以逆转。肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs) 的活化是引起肝纤维化的关键过程[3]。TGF-β1是最强的促纤维细胞因子[4]。研究[5-6]证实，阻断PI3K/AKT信号通路，能抑制肝纤维化。褪黑素(melatonin, Mel)是胺类激素，具有抗氧化、抗炎、抗纤维化等作用[7]。课题组前期研究[8]证明褪黑素对CCl4诱导的肝纤维化大鼠具有保护作用，但具体机制尚不清楚。该研究选用细胞实验检测褪黑素对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞增殖和PI3K/AKT信号通路的影响，探究褪黑素抗肝纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和细胞TGF-β1(美国PeproTech公司)；MTT、DMSO、褪黑素(美国Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)；DMEM高糖培养基(南京Wisent生物技术有限公司)；β-actin小鼠单克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；抗PI3K兔单克隆抗体、抗P-AKT兔单克隆抗体、抗AKT兔单克隆抗体(美国CST公司)；DBA染色液、免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；青霉素/链霉素、胰酶消化酶、BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；HSC-T6细胞(南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.2 细胞培养HSC-T6细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的高糖DMEM完全培养基中，细胞置于37 ℃、含5%CO2的培养箱中培养，每隔24 h换1次培养基，当细胞融合达70%～80%时传代培养，选用对数生长期阶段的细胞进行实验。

1.3 MTT实验选用对数生长期的HSC-T6 细胞，用胰酶消化，使细胞脱落，先计数细胞个数，测出浓度，再将其稀释成3×104个/ml的细胞悬液，以每孔200 μl铺板于96孔板中。为了防止干燥，边缘各孔均加入200 μl PBS。将细胞分成5组：对照组、模型组、褪黑素低浓度组(1 nmol/L)、褪黑素中浓度组(1 μmol/L)、褪黑素高浓度组(0.1 mmol/L)，静置5 min后把板置于培养箱中。培养24 h后，吸净培养基，先用PBS清洗，再换用无血清的培养基，除对照组外，其余各组均加入TGF-β1(10 ng/ml)，在三组不同浓度的褪黑素组加入对应浓度的褪黑素，将板置于37 ℃培养箱中。药物作用48 h后，吸净上清液，用PBS清洗后，每孔先加入180 μl无血清的培养基，再加入20 μl浓度为5 mg/ml 的MTT，反应4 h后，吸净上清液，每孔加入150 μl DMSO，把板置于震荡器中震荡10 min，充分溶解孔内的结晶，用酶标仪测定波长490 nm处各孔的光密度(optical density，OD)。

1.4 细胞免疫组化实验选用对数生长期的HSC-T6细胞，用胰酶消化，使细胞脱落，先计数细胞个数，测出浓度，再将其稀释成0.4×105个/ml的细胞悬液，把无菌的直径为15 mm的细胞爬片置于24孔板中，将已稀释的细胞悬液以每孔500 μl铺板于24孔板内的细胞爬片上。将细胞分成5组(同前)，静置5 min后把板置于培养箱中。培养24 h后，吸净培养基，先用PBS清洗，再换用无血清的培养基，除对照组外，其余各组均加入TGF-β1(10 ng/ml)，在三组不同浓度的褪黑素组加入对应浓度的褪黑素，将板置于37 ℃培养箱中。药物作用48 h后，吸净上清液，用PBS洗3次，每次3 min，为了固定细胞爬片上的细胞，滴加95%乙醇反应20 min，用PBS洗3次，每次3 min，将细胞爬片置于载玻片上，滴加0.3% Triton X-100孵育15 min，用PBS洗3次，每次3 min，滴加3%H2O2孵育10 min，用PBS洗3次，每次3 min，滴加血清孵育15 min，滴加一抗(P-AKT 1 ∶100)，置于4 ℃冰箱中过夜，次日置于37 ℃恒温箱中复温30 min后，用PBS洗3次，每次3 min，滴加二抗，置于37 ℃恒温箱中孵育15 min，用PBS洗3次，每次3 min，滴加辣根酶，置于37 ℃恒温箱中孵育15 min，用PBS洗3次，每次3 min，滴加DAB显色液，苏木精复染10 s后，用自来水冲洗，晾干后用中性树胶封片。HSC-T6细胞出现棕黄色或黄褐色为阳性显色，将显微镜调至200倍，镜下观察细胞的染色情况，随机拍摄6个不连续的视野，并将其保存。用Image-ProPlus 6.0软件测定每张图片中阳性区域的OD值，并得出每张爬片的平均OD值，最后用这个值来分析蛋白阳性表达的情况。

1.5 Western blot实验选用对数生长期的HSC-T6细胞，用胰酶消化后，加入培养基使细胞制成细胞悬液，将其接种于培养皿内。将细胞分成5组(同前)，把皿置于培养箱中。培养24 h后，吸净培养基，先用PBS清洗，再换用无血清的培养基，除对照组外，其余各组均加入TGF-β1(10 ng/ml)，在三组不同浓度的褪黑素组加入对应浓度的褪黑素，将皿置于37 ℃培养箱中。药物作用48 h后，提取细胞的总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，加热使蛋白变性，配制分离胶、浓缩胶，加样，电泳分离目的蛋白后，将目的蛋白转移到PVDF膜上，丽春红染色PVDF膜上的目的蛋白，用双蒸水洗3次，每次5 min，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，用双蒸水洗3次，每次5 min，滴加一抗(PI3K 1 ∶1 000，AKT 1 ∶1 000，P-AKT 1 ∶2 000，β-actin 1 ∶1 000)，置于4 ℃冰箱中的慢摇床上孵育过夜，次日置于室温复温30 min后，先用PBST洗3次，每次7 min，再用PBS洗1次，每次7 min，滴加二抗(1 ∶60 000)，置于摇床上室温孵育2 h后，先用PBST洗3次，每次7 min，再用PBS洗1次，每次7 min，将显影仪内的温度降至-40 ℃，滴加显影液显影，拍摄并保存显影的结果。用Image-ProPlus 6.0图像分析软件来分析结果，以β-actin为内参，以PI3K/β-actin的灰度比作为PI3K的相对表达量，以P-AKT/AKT的灰度比作为P-AKT的相对表达量。

1.6 定量PCR(qPCR)实验选用对数生长期的HSC-T6细胞，用胰酶消化后接种于培养瓶内。将细胞分成5组(同前)，把瓶置于培养箱中。培养24 h后，吸净培养基，先用PBS清洗，再换用无血清的培养基，除对照组外，其余各组均加入TGF-β1(10 ng/ml)，在三组不同浓度的褪黑素组加入对应浓度的褪黑素，将瓶置于37 ℃培养箱中。药物作用48 h后，提取细胞的总RNA，用紫外分光光度计测定RNA的浓度。消化残留的DNA：加入无酶水3 μl，RQ/Rnase 10×Recation Buffer 1 μl，RQ/Rnase-Free Dnase 2 μl，RNA 4 μl，离心混匀，置于37 ℃ PCR仪上，反应30 min，加入1 μl 终止液RQ/Dnase Stop Solution，置于70 ℃ PCR仪上，反应10 min；逆转录：加入10×buffer 和10 mmol/L dNTP 各2 μl，RNase 0.5 μl，AMV逆转录酶0.75 μl，随机引物1 μl、无酶水2.75 μl，离心混匀，置于42 ℃PCR仪上，反应60 min，置于95 ℃ PCR仪上，继续反应5 min；PCR扩增：加入无酶水7 μl，PCR反应Mix 10 μl，正向引物、反向引物、cDNA各1 μl，震荡混匀，加入96孔板中扩增。PCR扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，循环扩增共40次，末次循环结束后，分析电脑上的溶解曲线(检测引物的质量)，并记录CT值，选取β-actin作为内参，选用2-ΔΔCt法来分析目的基因的表达。α-SMA引物序列如下：F:5′-GGAGATGGCGTGACTCACAA-3′，R: 5′-CGCTCAGCAGTAGTCACGAA-3′；β-actin: F: 5′-CACCCGCGATACAACCTTC-3′，R:5′-C CCATACCCACCATCACACC-3′。

2 结果

2.1 MTT检测褪黑素对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞增殖的影响结果显示，与对照组相比，TGF-β1能显著诱导HSC-T6细胞增殖(F=11.886，P<0.01)；与模型组相比，各浓度褪黑素组均能抑制HSC-T6细胞增殖，且褪黑素的浓度越高，抑制作用越明显(F=11.886，P<0.01)。见表1。

表1 褪黑素对TGF-β1诱导的 HSC-T6细胞增殖的影响

与对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：##P<0.01

2.2 细胞免疫组化检测褪黑素对HSC-T6细胞中P-AKT蛋白表达的影响P-AKT蛋白主要表达于HSC-T6细胞胞质。与对照组相比，模型组中P-AKT蛋白的表达明显增多(F=42.019，P<0.01)；与模型组相比，各浓度褪黑素组中P-AKT蛋白的表达明显减少(F=42.019，P<0.01)，且褪黑素的浓度越高，P-AKT蛋白表达减少越明显。见图1。

2.3 Western blot检测褪黑素对HSC-T6细胞中PI3K和P-AKT蛋白表达的影响与对照组相比，模型组中PI3K和P-AKT蛋白的表达明显增多(F=9.466、F=63.672，P<0.01)；与模型组相比，各浓度褪黑素组中PI3K和P-AKT蛋白的表达均明显减少(F=9.466、F=63.672，P<0.01或P<0.05)，且褪黑素的浓度越高，PI3K和P-AKT蛋白表达减少越明显。见图2、3。

2.4 qPCR检测褪黑素对HSC-T6细胞中α-SMA mRNA表达的影响与对照组相比，模型组中α-SMA mRNA的表达明显增多(F=70.672，P<0.01)；与模型组相比，各浓度褪黑素组中α-SMA mRNA的表达均明显减少(F=70.672，P<0.01)，且褪黑素的浓度越高，α-SMA mRNA表达减少越明显。见图4。

图1 褪黑素对HSC-T6细胞中P-AKT蛋白表达的影响 ICC×200

A：对照组；B：模型组；C：褪黑素低浓度组；D：褪黑素中浓度组；E：褪黑素高浓度组；与对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：##P<0.01

图2 褪黑素对HSC-T6细胞中PI3K蛋白表达的影响

A：对照组；B：模型组；C：褪黑素低浓度组；D：褪黑素中浓度组；E：褪黑素高浓度组；与对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

肝纤维化是一种复杂的肝细胞修复反应，各种致病因素(如病毒、药物和酒精等)长期持续损害肝脏，引起HSCs活化，分泌大量ECM并过度沉积，破坏肝脏结构，从而导致肝纤维化[3]。若不有效治疗，肝纤维化最终将进展为肝硬化、肝癌。有研究[2]表明，肝纤维化是可以逆转的。因此，研发安全有效的抗肝纤维化药物有重要的临床意义。

图3 褪黑素对HSC-T6细胞中P-AKT蛋白表达的影响

A：对照组；B：模型组；C：褪黑素低浓度组；D：褪黑素中浓度组；E：褪黑素高浓度组；与对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：##P<0.01

图4 褪黑素对HSC-T6细胞中α-SMA mRNA表达的影响

A：对照组；B：模型组；C：褪黑素低浓度组；D：褪黑素中浓度组；E：褪黑素高浓度组；与对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：##P<0.01

褪黑素是松果体分泌的胺类激素，具有调节免疫、抗氧化、抗炎、抗纤维化等功能。Lebda et al[9]研究表明，褪黑素能增强抗氧化活性，减少促炎细胞因子和纤维化基因表达，减少HSCs增殖，从而抗肝纤维化。Kang et al[10]研究表明，褪黑素能增强线粒体自噬和线粒体生物合成，从而抗肝纤维化。本课题组前期研究[8]表明，褪黑素具有抗肝纤维化作用，但具体机制尚不明确。

HSCs是一种间质细胞，位于肝脏Disse间隙。在正常情况下，HSCs处于静止状态，其主要功能是储存和代谢VitA，合成和分泌少量的ECM。当各种致病因素引起肝脏损伤时，在TGF-β和血小板衍生生长因子(PDGF)等多种细胞因子作用下，HSCs 活化，转化为肌成纤维细胞，表达大量的α-SMA，合成过多的胶原蛋白，使ECM在肝脏过度沉积，从而导致肝纤维化[11]。α-SMA是 HSCs活化的标志。因此，抑制HSCs活化与增殖成为抗肝纤维化的重要靶点。MTT结果显示，TGF-β1能显著诱导HSC-T6细胞增殖，而高浓度褪黑素能显著抑制HSC-T6细胞增殖；qPCR结果显示，TGF-β1能增强HSC-T6细胞中α-SMA mRNA的表达，而褪黑素能明显抑制α-SMA mRNA的表达。推测褪黑素可能通过抑制HSC-T6细胞增殖，抑制ECM合成，从而抗肝纤维化。

PI3K/AKT信号通路在肝纤维化发生发展中起重要的作用[12]。PI3K是磷脂酰肌醇-3-激酶，由调节亚基p85和催化亚基p110组成，具有丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶和磷脂酰肌醇激酶的双重活性。AKT是一种丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶。当细胞外的配体与相应的受体结合后，激活PI3K，改变p85和p110复合体的构象，使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(简称PIP2)生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(简称PIP3)。PIP3与AKT结合后，使AKT从胞质转移到胞膜。PDK1磷酸化AKT的Thr308位点，PDK2磷酸化AKT的Ser473位点，从而活化AKT[13]。有研究[12]证实，积雪草酸通过抑制PI3K/AKT信号通路，抑制HSCs活化和ECM合成，从而抗肝纤维化。细胞免疫组化和Western blot结果显示，TGF-β1能明显增强HSC-T6细胞中PI3K和P-AKT蛋白的表达，而褪黑素能明显抑制PI3K和P-AKT蛋白的表达。推测褪黑素可能通过抑制PI3K/AKT信号通路，从而抑制HSC-T6细胞增殖。

综上，褪黑素能抑制HSC-T6细胞活化与增殖，抑制ECM合成，可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。本实验仅为初步研究，具体机制仍需进一步探究。