基于DNA酶表面增强拉曼的皮蛋中痕量Pb2+检测方法

庞永丰，罗杨合，2，吴凤莲，2，伍淑婕，聂辉，段振华，2，黎小椿，*

（1.贺州学院食品科学与工程技术研究院，广西贺州542899；2.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034）

铅是一种对人体有害的重金属元素。当铅在人体的累积量超过一定量时，就会对人体造成严重损害。同时铅会损害儿童神经系统发育，进而会导致其智能指数下降10 分~20 分[1]。通过调查研究了解到，目前部分耕地受到了重金属的污染[2]。因此，对重金属的检测和预防，并运用一些科学、灵敏、稳定、简便和快速的检测方法对重金属进行定量检测，具有重要的研究意义。

目前，常用于对样品中重金属铅的检测方法分别为：原子荧光法[3]、原子吸收分光光度法[4]、电感耦合等离子体质谱法[5]、激光诱导击穿光谱法[6]、双硫腙比色法[7]以及表面增强拉曼散射光谱法（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）[8]。其中，原子荧光法的优点是检出限相对较低，灵敏度较高，共存物质的干扰较小，对重金属检测的线性范围较宽，可以同时对多种元素进行检测；缺点是在对样品检测过程中，会产生荧光淬灭效应以及散射光等问题的干扰。原子吸收分光光度法的优点是选择性高，干扰少，灵敏度高，准确度高；缺点是不能对多元素同时分析，对难熔元素测定的灵敏度不高。电感耦合等离子体质谱法的优点是对样品中的物质测定较为准确、快速，且灵敏度较高，共存物质的干扰较小；缺点是对于电离电位高的元素灵敏度低。激光诱导击穿光谱法的优点是可以远程和实时对元素进行在线检测，并且可以进行多元素同时检测；缺点是检测较慢，不能对元素进行准确的定量分析。双硫腙比色法优点是操作简便、快速和稳定性好；缺点是双硫腙的添加量不易控制，造成误差较大。与上述其它方法相比较，SERS 法具有操作简便、检测快速、灵敏度高、分析准确等优点，是一种理想的重金属检测新方法。Mark S.Frost 等[9]成功地证明了SERS方法是一种检测在水介质中Pb2+的高灵敏度方法。试验结果表明，SERS 具有高灵敏度（LOD25 ng/L），在很宽的线性范围内（25 ng/L~1 000 ng/L）Pb2+离子可以准确地被检测出来。所以建立精确SERS 法定量分析重金属铅具有重要研究意义。

SERS 法常被用于重金属离子的分析与检测[10-12]。其主要原因是SERS 技术可以提供化学和生物分子结构方面的指纹信息，同时也可以对痕量物质进行检测。近年来，基于DNA 酶裂解反应SERS 法检测分析物非常受研究人员的关注，因为其可以用于提高对物质检测的灵敏度、选择性以及检测速度[13-15]。Wang 等[16]通过试验探究，建立了一种测定Pb2+的DNA 酶传感器SERS 探针的新方法，其原理是当体系中加入Pb2+后，Pb2+可切割DNA 的底物链使得纳米金共轭物与金基底分离，使得拉曼信号变弱。且在一定Pb2+的浓度范围内，Pb2+的浓度与SERS 信号强度的变化，呈现良好的线性关系，从而可对Pb2+进行痕量分析检测。但目前对于Pb2+的SERS 定量分析方法相对较少，基于DNA 酶裂解反应与银纳米粒子、罗丹明6G（rhodamine 6G，Rh6G）结合并应用于对重金属Pb2+的SERS 定量检测分析方法尚未见报道。

研究发现，将SERS 与适配体和DNA 酶相结合，有助于对痕量物质更好地进行检测分析。因此，本文以性质稳定的液相银纳米溶胶为基底，建立痕量重金属铅离子的DNA 酶SERS 定量分析新技术，并用于皮蛋中痕量重金属铅离子的检测分析，既具有科学的理论技术创新，同时又具有良好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

633 nm DXR smart 智能拉曼光谱仪：美国赛默飞世尔公司，激光为633 nm，功率为3.0 mW，采集时间为10 s；MR Hei-Tec 加热型磁力搅拌器：德祥科技有限公司；Evolution300 型紫外可见分光光度计：美国热电（上海）科技仪器有限公司；F-4600 荧光分光光度计：日立高新技术公司；WX-8000 微波消解仪：上海屹尧仪器科技发展有限公司；XMTD-8222 恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；1524R 高速离心机：珠海黑马医学仪器有限公司；扫描电镜（scanning electronic microscope，SEM）：日本日立公司。

1.2 主要试剂

AgNO3（分析纯）：广东光华科技股份有限公司；NaBH4（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；NaCl（分析纯）/HCl（36%~38%）/10 g/L 柠檬酸三钠：汕头西陇化工厂有限公司；5.23×10-5mol/L 罗丹明6G（Rh6G）：美国MERCK 公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二钠（disodium ethylenediamine tetraacetic acid，EDTANa2）：成都市科龙化工试剂厂。

混合溶液：依次加入3.72 mL 0.2 mol/L EDTANa2、5 mL 2 mol/L NaCl、0.5 mL 0.2 mol/L Tris，混匀后定容到16 mL，以EDTANa2计算其浓度为4.65×10-2mol/L。

pH 7.2 的Tris-HCl 缓冲液：依次加入5.0 mL 0.2 mol/L Tris、9.0 mL 0.1 mol/L HCl，混合均匀后定容到20 mL。

1.3 双链DNA（dsDNA）的制备

在15 mL 的比色管中，依次加入0.5 mL 0.144 μmol/L的ssDNA、0.5 mL 0.144 μmol/L 的Taq 酶、360 μL 2 mol/L的NaCl、1.45 mL pH 7.2 的Tris-HCl、5.19 mL 的超纯水，混匀后于80 ℃水浴锅中水浴加热15 min。水浴完毕取出，将其自然冷却1.5 h，然后保存于4 ℃冰箱。

1.4 银纳米粒子溶液制备

量取40.0 mL 超纯水于100 mL 锥形瓶中，用磁力搅拌器搅拌（500 r/min），依次加入3.5 mL 10 g/L 柠檬酸三钠溶液和0.385 mL 2.4×10-2mol/L AgNO3，搅拌混匀后，逐滴缓慢滴加4.0 mL 0.5 g/L NaBH4，溶液颜色从浅黄色→深黄色→黄色，继续搅拌反应15 min 后，定容于50 mL 棕色容量瓶，得到19.9 mg/L 银纳米粒子（AgNPs）溶液，于4 ℃冰箱保存。

1.5 皮蛋消解液的制备

微波消解皮蛋：称量1.242 0 g 的皮蛋加入到微波消解罐中，然后依次加入5 mL 的浓硝酸和2 mL 30%的过氧化氢，将微波消解仪的温度设定为100 ℃，压力分别为3、6、9atm，微波功率分别为1000、1000、2000W。加热时间分别设定为5、7、5 min，进行微波消解，然后进行加热赶酸，再将加热后的溶液定容到25 mL 棕色容量瓶中。量取2 mL 皮蛋微波消解液，进行高速离心，取上清液，过滤，然后取1 mL 皮蛋消解滤液样品稀释20 倍，得2.484 mg/mL 皮蛋消解液。

1.6 试验方法

在5 mL 刻度试管中，依次加入120 μL 9 nmol/L dsDNA 溶液，一定量的Pb2+溶液，混匀25 ℃下静置8 min后加入10 μL 4.65×10-2mol/L 混合溶液，混匀后加入400 μL 19.9 mg/L 银纳米粒子溶液，摇匀后加入70 μL 5.23×10-5mol/L 的Rh6G 溶液，定容至2.0 mL。取反应液于石英皿中，然后将其过测定613 cm-1处的SERS峰强度I，不加Pb2+做空白为I0，计算ΔI=I-I0。

1.7 试验原理

在pH 7.2 的Tris-HCl 缓冲液和0.09 mol/L NaCl介质中，单链DNA（ssDNA）和DNA 酶在80 ℃条件下，杂交成双链DNA（dsDNA）。在dsDNA 和混合溶液存在下，AgNPs 发生聚集，聚集的AgNPs 与Rh6G 相互作用，在613 cm-1处出现较强的SERS 特征峰。Pb2+可将dsDNA 裂解切割，释放出ssDNA，形成比表面积和粗糙度均增大的AgNPs-ssDNA-Pb2+大分子缔合物。随着Pb2+浓度的增大，释放出的ssDNA 增多，形成的Ag－NPs-ssDNA-Pb2+增多，AgNPs-ssDNA-Pb2+与Rh6G 作用增强，导致613 cm-1处的SERS 峰强度增大。

2 结果与讨论

2.1 SERS 光谱

Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系的SERS 光谱见图1。

图1 Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系的SERS 光谱Fig.1 Raman scattering Spectra of Pb2+-dsDNA-AgNPs system

当无Pb2+存在时，dsDNA 不能保护AgNPs 在混合溶液存在下发生聚集，聚集的AgNPs 与Rh6G 结合较弱，在613 cm-1拉曼位移处出现SERS 特征峰。当加入Pb2+，形成比表面积和粗糙度均增大的AgNPs-ssDNAPb2+大分子缔合物，AgNPs-ssDNA-Pb2+与Rh6G 结合，在613 cm-1处有较强的SERS 峰。随着Pb2+浓度的增大，613cm-1处的SERS 峰线性增强，故本文选择613 cm-1处进行测定，结果见图2。

图2 Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系的SERS 光谱Fig.2 Raman scattering Spectra of Pb2+-dsDNA-AgNPs system

2.2 吸收光谱

紫外-可见吸收测纳米银图见图3，Pb2+-dsDNAAgNPs 体系的吸收光谱图见图4。

图3 紫外-可见吸收测纳米银图Fig.3 Ultraviolet absorption determination of silver nanoparticle

图4 Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系的吸收光谱图Fig.4 Absorption spectra of Pb2+-dsDNA-AgNPs system

球形AgNPs 溶胶呈黄色，由图3 可知其吸收峰主要在394 nm。AgNPs 溶胶聚集后呈灰蓝色，Rh6G 溶液呈橙红色，图4 中530 nm 处的吸收峰是AgNPs 聚集体与Rh6G 作用的结果。在Pb2+存在的条件下，Pb2+可裂解切割dsDNA，释放ssDNA，形成比表面积和粗糙度均增大的高褶皱度叶子状AgNPs-ssDNA-Pb2+大分子缔合物。随着Pb2+浓度增加，形成的AgNPs-ssDNAPb2+缔合物增多，AgNPs 聚集体减少，AgNPs-ssDNAPb2+与Rh6G 作用增强，体系中AgNPs 聚集体的灰蓝色减少而Rh6G 的橙红色增强，故530 nm 的吸收峰增强。此结果与SERS 光谱一致。

2.3 共振散射光谱

Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系的共振散射光谱如图5所示。

图5 Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系的共振散射光谱图Fig.5 Resonance scattering spectra of Pb2+-dsDNA-AgNPs system

在dsDNA 和混合溶液存在下，AgNPs 发生聚集，在545 nm 处有一个较强的共振散射光谱峰。当加入Pb2+后，Pb2+可裂解切割dsDNA，释放ssDNA，ssDNA 吸附在AgNPs 表面，形成比表面积和粗糙度均增大的高褶皱度叶子状AgNPs-ssDNA-Pb2+大分子缔合物，Ag－NPs 聚集体减少，导致545 nm 处的共振散射峰强度降低。其共振散射值随Pb2+的加入量增大而降低。此结果与SERS 光谱一致。

2.4 SEM 表征

扫描电镜图见图6。

通过扫描电镜（SEM）结果表明所制备的AgNPs形状是球形，其平均尺寸约为90 nm（图6a）。在0.54 nmol/L dsDNA-3.98 mg/L AgNPs-2.325×10-4mol/L混合溶液的存在下，AgNPs 颗粒聚集（图6b）。当加入Pb2+后，Pb2+可裂解切割dsDNA，释放出ssDNA，ssDNA吸附在AgNPs 表面，形成比表面积和粗糙度均增大的高褶皱度叶子状AgNPs-ssDNA-Pb2+大分子缔合物（图6c）。AgNPs-ssDNA-Pb2+大分子缔合物具有高SERS 活性，这与试验分析原理一致。

图6 测银纳米的扫描电镜图Fig.6 Scanning electron microscopy of silver nanoparticles

2.5 Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系的条件优化

2.5.1 AgNPs 浓度的影响

银纳米粒子浓度的影响见图7。

图7 银纳米粒子浓度的影响Fig.7 Effects of concentration of silver nanoparticles

探讨AgNPs 浓度对Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系的影响，当体系中没有加入AgNPs 时，SERS 信号很弱，几乎为0。当AgNPs 的加入量逐渐增大时，SERS 信号的变化值ΔI 也在逐渐增大。当AgNPs 的浓度为3.98 mg/L时，ΔI 达到最大值，故选择AgNPs 的浓度为3.98 mg/L。

2.5.2 混合溶液浓度的影响

图8 混合溶液的影响Fig.8 Effects of mixed solution

混合溶液的影响见图8。如图8 所示，以AgNPs 为基底，当体系中没有加入混合溶液时，SERS 信号的变化量ΔI 较弱。当混合溶液的加入量逐渐增大时，SERS信号的变化值ΔI 也在逐渐增大。当混合溶液的浓度为2.325×10-4mol/L 时，ΔI 达到最大值，由于随着混合溶液浓度的增大，所含的氯化钠浓度也随之增大，Ag－NPs 颗粒聚集过大，导致ΔI 值逐渐减小，故选择混合溶液的浓度为2.325×10-4mol/L。

2.5.3 dsDNA 浓度的影响

探讨dsDNA 浓度对Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系的影响结果见图9。

图9 dsDNA 浓度的影响Fig.9 Effects of dsDNA concentration

AgNPs 为基底，当体系中没有加入dsDNA 时，SERS 信号很弱。当dsDNA 的加入量逐渐增大时，SERS 信号的变化值ΔI 也在逐渐增大。当dsDNA 的浓度为0.54 nmol/L 时，ΔI 达到最大值，故选择dsDNA 的浓度为0.54 nmol/L。

2.5.4 Rh6G 浓度的影响

探讨Rh6G 浓度对Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系的影响，结果见图10。以AgNPs 为基底，当体系中没有加入Rh6G 时，SERS 信号很弱，几乎为0。随着Rh6G 浓度不断增大，SERS 信号的变化量ΔI 不断增大。当Rh6G的浓度为1.830 5×10-6mol/L 时，ΔI 达到最大值，因此选择Rh6G 的浓度为1.830 5×10-6mol/L。

图10 Rh6G 浓度的影响Fig.10 Effects of Rh6G concentration

2.5.5 加样顺序对测Pb2+体系的影响

探讨加样顺序Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系的影响，结果见图11。

由图11 可知，当加样顺序为“dsDNA+Pb2++AgNPs+混合溶液+Rh6G”时，线性关系较好。

图11 加样顺序对体系的影响Fig.11 Effects of sample order on system

2.5.6 共存物质的影响

根据试验方法探讨在Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系中，共存离子的存在条件下对测定结果的影响，结果见图12。

图12 共存物质对体系的影响Fig.12 Effects of coexisting substances on the system

当Pb2+浓度为5.0×10-7mol/L 时，6.5×10-6mol/L Ba2+，3.9×10-6mol/L Cu2+，2.5×10-6mol/L K+，8.3×10-6mol/L Co2+，2.5×10-6mol/L Ca2+，5.0×10-6mol/L Fe3+，2.0×10-7mol/L Hg2+，1.5×10-5mol/L Ni2+，1.2×10-5mol/L Ag+，5.0×10-6mol/L Mn2+，1.5×10-5mol/L 异亮氨酸、天冬氨酸、精氨酸等干扰物质对Pb2+的测定无干扰，且相对误差在±10%内。

2.6 Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系的稳定性和重现性

探究Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系的稳定性和重现性，结果见表1。

按试验方法，同一批次的AgNPs 测定2.5×10-7mol/LPb2+，同组平行测定10 次。不同批次的AgNPs 测定2.5×10-7mol/L Pb2+，同组平行测定10 次。结果表明，同一批次的AgNPs 测定2.5×10-7mol/L Pb2+，平均值均在误差范围10%之内，不同批次的AgNPs 测定2.5×10-7mol/L Pb2+，平均值均在误差范围10%之内，体系具有一定的稳定性和重现性。

表1 Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系*的重现性和稳定性Table 1 Reproducibility and stability of Pb2+-dsDNA-AgNPs system*

2.7 工作曲线

Pb2+的标准曲线见图13。

根据试验方法，以AgNPs 作为基底，在最佳试验条件下做工作曲线，Pb2+浓度与ΔI 的线性回归方程为ΔI=16.962x-127.97，R2=0.993 5，如图13 所示；Pb2+的检测范围在2.5×10-8到7.5×10-7mol/L 之间。本试验方法是一种较好的快速检测Pb2+的新方法。

2.8 与测定铅的国标分析方法比较

图13 Pb2+的标准曲线Fig.13 Standard curve of Pb2+

通过将DNA 酶SERS 测定痕量重金属（Pb2+）与测定铅的国标分析方法比较，得出结果如表2 所示，用国标法检测痕量重金属铅，有其优点和不足，而DNA 酶SERS 法，则是在其优点的基础上，弥补了其不足之处。

表2 测定Pb2+的国标分析方法比较Table 2 Comparison of GB analytical methods for determination of Pb2+

2.9 测定皮蛋中的重金属铅离子

取2.484 mg/mL 的皮蛋消解液样品，以AgNPs 作为基底，按试验方法测定铅离子含量，结果见表3。

结果表明，相对标准偏差均在10%以内，回收率在99.5%～107.7%之间。

表3 Pb2+-dsDNA-AgNPs 体系测定皮蛋中的Pb2+Table 3 Pb2+-dsDNA-AgNPs system for determination of Pb2+in preserved eggs

3 结论

通过采用还原法可快速制备黄色球形纳米银。在一定条件下，将ssDNA 和DNA 酶杂交形成dsDNA。在dsDNA 和混合溶液存在条件下，AgNPs 发生聚集，聚集的AgNPs 与Rh6G 作用较强，在613 cm-1处出现较强的SERS 特征峰。Pb2+可将dsDNA 裂解切割，释放出ssDNA，形成比表面积和粗糙度均增大的AgNPs-ssDNA-Pb2+大分子缔合物。随着Pb2+浓度的增大，释放出的ssDNA 增多，形成的AgNPs-ssDNA-Pb2+增多，Ag-NPs-ssDNA-Pb2+与Rh6G 作用增强，导致613 cm-1处的SERS 峰强度增大。在选定条件下，Pb2+在2.5×10-8～7.5×10-7mol/L 浓度之间，与其SERS 峰强度的变化值呈良好线性关系，ΔI=16.962x-127.97，R2=0.993 5，Pb2+的最低检出浓度为1.0×10-8mol/L。用建立的方法测定皮蛋中的Pb2+，相对标准偏差（RSD）均在10%以内，回收率在99.5%～107.7%之间。由此可知，该方法有望在检测农产品重金属中，得以广泛应用。