林下参根皂苷类化合物优化提取与鉴定

肖涵，张群，王玮铨，韩宇，冯印，尤丽新，胡楠楠，陈海燕，*

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118；2.长春科技学院，吉林长春130600）

林下参（Panax ginseng C.A.Meyer cv.Silvatica），别名籽海山参，人为将其种子播种到自然环境中，使其自然生长，生长于天然针阔叶混交林或阔叶次生林，主要产于吉林省、辽宁省长白山山脉和黑龙江省。林下参生长周期长，富含野生人参的珍贵营养成分，大补元气、回阳散逆、滋阴、益血、生津、强心，所含的有效活性成分人参皂苷（ginsenoside）具有防癌抗肿瘤、增强免疫力、抗心律失常、延缓衰老、抗疲劳、改善记忆与学习能力、消炎解毒、抗血栓等药理作用，本次试验通过超声辅助法进行提取，紫外分光光度法和高效液相色谱法进行定性定量，对林下参根中有效活性成分进行研究，借助响应面法进行优化，为林下参根皂苷类化合物研发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生林下参：吉林省长白山抚松县；甲醇、乙醇、正丁醇、正戊醇、冰乙酸、高氯酸：天津市富宇精细化工有限公司；香草醛：天津市光复科技发展有限公司；D101大孔吸附树脂：山东东鸿化工有限公司；人参皂苷Ro标准品、人参皂苷Rd 标准品：成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

YP202N 型电子天平：上海舜宇恒平科技仪器有限公司；KQ-250DE 型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SHZ-D（III）型循环水真空泵：邦西仪器科技（上海）有限公司：GZX-9140MBE 型电热鼓风干燥箱：博讯实业有限公司医疗设备厂；UVmini-1280 型紫外分光光度计：岛津（苏州）有限公司。

1.3 人参皂苷的提取

1.3.1 大孔吸附树脂预处理

本试验使用D101 型大孔吸附树脂，湿法装柱后使乙醇液面高于树脂层约10 cm，浸泡4 h~5 h，用乙醇以2 BV/h 的流速通过树脂层，洗至流出液与2 倍体积的水混合后澄清为止。用水以同样流速通过树脂柱，至无醇味为止，即可投入使用。

1.3.2 人参皂苷的提取

样品的制备：野生林下参洗净切片，烘干粉碎，过20 目筛，置密封袋中保存备用。

人参皂苷的提取：准确称取5.00 g 林下参根粉末，按一定料液比加入一定浓度的溶剂，浸提30 min 后超声辅助提取，真空抽滤，滤渣重复上述提取步骤，共提取3 次，合并提取液，提取液过D101 大孔吸附树脂进行纯化，乙醇洗脱，收集洗脱液，进行浓缩干燥，得到人参皂苷样品。

1.3.3 人参皂苷含量的测定

标准曲线和回归方程的建立：准确称取0.015 g 人参皂苷样品粉末溶于甲醇并定容至50 mL，备用。准确称取0.506 1 g 香草醛溶于冰醋酸并定容10 mL，备用。分别取已配好的人参皂苷母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于6 支干净的试管中，水浴蒸干，再向每支试管加入高氯酸0.8 mL 和香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，70 ℃水浴30 min，冰浴降温后向各试管加入冰醋酸5 mL，在545 nm 处测定吸光值。以吸光度为纵坐标（y），标品含量为横坐标（x），绘制标准曲线，得回归方程。

人参皂苷含量测定：准确称取人参皂苷样品0.015 0 g，溶于甲醇并定容至50 mL 为样液，备用。按上述标准曲线的建立条件进行样液的吸光度测定，将吸光度代入回归方程得样品中人参皂苷的含量。

1.4 单因素试验设计

1.4.1 溶剂对提取量的影响

准确称取5 g 林下参根粉末5 份，按料液比1 ∶15（g/mL）分别加入水、80 %甲醇、80 %乙醇、80 %丁醇、80 %戊醇75 mL，浸提30 min，30 ℃超声辅助30 min，重复3 次，得粗滤液。

1.4.2 溶剂浓度对提取量的影响

准确称取5 g 林下参根粉末5 份，按料液比1 ∶15（g/mL）分别加入45%、55%、65%、75%、85%的乙醇75 mL，浸提30 min，30 ℃超声辅助30 min，重复3次，得粗滤液。

1.4.3 料液比对提取量的影响

准确称取5 g 林下参根粉末4 份，按料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）加入65%乙醇，浸提30 min，30 ℃超声辅助30 min，重复3 次，得粗滤液。

1.4.4 超声温度对提取率的影响

准确称取5 g 林下参根粉末4 份，按料液比1 ∶15（g/mL）加入65%的乙醇75 mL，浸提30 min，20、30、40、50 ℃超声辅助30 min，重复3 次，得粗滤液。

1.4.5 超声辅助时间对提取量的影响

准确称取5 g 林下参根粉末5 份，按料液比1 ∶15（g/mL）加入65%的乙醇75 mL，浸提30 min，30 ℃超声辅助20、30、35、40 min，重复3 次，得粗滤液。

1.5 提取率计算

通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）鉴定最佳提取方案所得样品，对比标品峰与样品峰的峰面积，根据公式（1）计算得到样品中人参皂苷的提取率。

1.6 响应面法优化提取方案

通过单因素试验，选取3 个因素3 个水平进行响应面试验设计，水平分别以-1、0、1 编码，以吸光度为响应值进行优化，见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Response surface test factor level table

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以标品溶液中标品含量（mg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，见图1~图2，得回归方程y1=4.068 9x+0.012（R2=0.999 1）和y2=5.240 1x+0.005 4（R2=0.999 2）。

图1 人参皂苷Ro 标准曲线Fig.1 Standard curve of ginsenoside Ro

图2 人参皂苷Rd 标准曲线Fig.2 Standard curve of ginsenoside Rd

2.2 单因素结果与分析

2.2.1 溶剂种类对提取量的影响

分别以水、80%甲醇、80%乙醇、80%正丁醇、80%正戊醇作为溶剂进行人参皂苷的提取，通过回归方程计算出样品中人参皂苷Ro 和Rd 的含量绘制折线图，结果见图3。

图3 溶剂种类对提取量的影响Fig.3 Influences of solvent type on extracting amount

由图3 可知，在受试溶剂中乙醇的提取量最高，正丁醇的提取量最低，各溶剂对于人参皂苷Ro 的提取量高于人参皂苷Rd 的含量，故选取乙醇为提取溶剂。

2.2.2 乙醇浓度对提取量的影响

分别以45%、55%、65%、75%、85%的乙醇作为溶剂进行人参皂苷的提取，计算样品中人参皂苷Ro和Rd 的含量绘制折线图，结果见图4。

图4 乙醇浓度对提取量的影响Fig.4 Influences of ethanol concentration on extracting amount

由图4 可知，乙醇浓度对人参皂苷的提取量影响明显，提取量与乙醇浓度成正比，浓度达到65%后提取量变化不明显，本着节约资源成本的原则，选择65 %乙醇为最佳浓度。

2.2.3 料液比对提取量的影响

分别按料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）进行人参皂苷的提取，计算样品中人参皂苷Ro 和Rd 的含量绘制折线图，结果见图5。

图5 料液比对提取量的影响Fig.5 Influences of solvent/solid ratio on extracting amount

由图5 可知，料液比对人参皂苷提取量的影响随着料液比的增加而升高，料液比达到1 ∶15（g/mL）以后，提取量变化不明显，即料液比1 ∶15（g/mL）可以将有效成分基本提取完全，选择1 ∶15（g/mL）为最佳料液比。

2.2.4 提取温度对提取量的影响

分别用20、30、40、50 ℃的超声温度进行人参皂苷的提取，计算样品中人参皂苷Ro 和Rd 的含量绘制折线图，结果见图6。

图6 提取温度对提取量的影响Fig.6 Influences of extraction temperature on extracting amount

由图6 可知，提取温度对人参皂苷的提取量有显著影响，温度在20 ℃～30 ℃之间呈现增长趋势，30 ℃达到最高值，在30 ℃～50 ℃之间，温度越高提取量越低，猜测因为温度的升高使某些有效成分分解，从而造成提取量的下降，选择30 ℃为最佳超声提取温度。

2.2.5 提取时间对人参皂苷样品吸光度的影响

分别以20、25、30、35、40 min 的超声时间进行人参皂苷的提取，计算样品中人参皂苷Ro 和Rd 的含量绘制折线图，结果见图7。

由图7 可知，提取时间在20 min～35 min 之间时，时间与提取量成正比，达到30 min 后提取量升高不明显；在35 min～40 min 之间时，随着时间增长提取量降低，猜测超声时间过长导致提取干扰杂质过多，从而有效成分提取量降低，因而选择30 min 为最佳超声提取时间。

图7 提取温度对提取量的影响Fig.7 Influences of extraction time on extracting amount

2.3 响应面优化结果与分析

2.3.1 响应面试验设计

根据单因素的结果分析，按照中心组合试验设计原理，选取乙醇浓度、料液比、超声时间进行三因素三水平的试验设计，因素水平分别以-1、0、1 编码，以吸光度为响应值，见表1。以乙醇浓度（A）、料液比（B）、超声时间（C）为自变量，以人参皂苷样品的吸光度为响应值（Y），用Design-expert 8.0.6.1 软件进行响应面数据分析，得回归方程为：

Y=0.92-0.014×A+0.016×B+9.313×10-3×C+4.050×10-3×A×B+3.200×10-3×A×C-7.250×10-4×B×C-0.12×A2-0.10×B2-0.077×C2。方差分析结果见表2。

由表2 可知，A、B、C、AC、BC、A2、B2、C2因素对人参皂苷样品吸光度的影响显著，其中乙醇浓度和料液比以及超声时间交互作用也会对样品吸光度有显著影响。分析方程方差，由总模型P＜0.001 可知本试验所选取的二次多项式模型具有高度的显著性；失拟项为0.927 3＞0.05，故失拟项不显著；R2=0.995 8 和R2adj=0.990 4 说明模型可以解释99.04%响应值的变化，说明该模型的拟合度较好。

表2 方差分析结果Table 2 Variance analysis results

2.3.2 响应面图分析

根据多元回归方程得到的三因素对林下参根中提取的人参皂苷吸光度具有影响的响应面图，见图8。

图8 三因素对样品吸光度值影响的响应面图Fig.8 Response surface plots showing the interactive effects of ethanol concentration，solvent/solid ratio，time on the ginsenoside extraction yield

由图8 可知，三因素间交互作用不显著，在相同试验条件下，随着乙醇浓度的增加，人参皂苷提取量呈现增长趋势；超声提取时间的增长，提取的人参皂苷含量呈现先增后降的趋势，考虑可能是由于加热时间过久其中的部分皂苷出现分解，从而使皂苷出现少量的减少；对于料液比对提取的影响，显示随着料液比的变化，提取的皂苷呈现增长的趋势，呈现正相关。

2.3.3 最佳条件预测及验证试验

通过Design-expert 8.0.6.1 软件进行数据分析，得到林下参中人参皂苷样品的最佳提取条件是乙醇浓度为65.4 %；料液比为1 ∶21（g/mL）；超声时间为32 min。在理论上林下参人参皂苷样品的吸光度为1.018 7，考虑实际情况，确定最佳提取条件是乙醇浓度为65%；料液比为1 ∶20（g/mL）；超声时间为30 min。在此条件下提取3 次，样品吸光度分别为1.021 3、0.998 7、1.015 6，平均值为1.011 9，与理论值想接近。将吸光度代入标准曲线回归方程，得人参皂苷Ro 和Rd 含量分别为0.246、0.192 mg，以人参皂苷Ro 和Rd标准品为提取标准，则提取率分别为82%和64%。

2.4 最佳方案HPLC 鉴定结果

通过响应面优化得到最佳的提取方案，按照该方案提取得到样品进行液相检测，色谱条件为，色谱柱：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温35 ℃；流速1 mL/min；波长：203 nm；流动相为乙腈：0.1%磷酸水=35 ∶65。人参皂苷Ro 和Rd 标准品溶液HPLC 色谱图见图9。

样品溶液HPLC 色谱图见图10。

根据出峰时间可知图10 中1' 号峰为人参皂苷Ro，2'峰为人参皂苷Rd。对比样品与标品HPLC 色谱图，根据公式（1）计算可得样品中人参皂苷Ro 的提取率为74.6%，人参皂苷Rd 的提取率为87.1%。

图9 人参皂苷Ro 和Rd 标准品溶液HPLC 色谱图Fig.9 HPLC chromatograms of ginsenoside Ro and ginsenoside Rd standards

图10 样品溶液HPLC 色谱图Fig.10 HPLC chromatograms of ginsenoside Ro and ginsenoside Rd samples

3 结论

通过单因素试验对溶剂种类、溶剂浓度、料液比、温度及时间进行研究后发现，乙醇在受试溶剂中提取量最高，提取量随溶液体积的增加而增长，提取量随提取温度和时间的增加呈现先上升后下降的趋势。选取三因素三水平进行响应面优化，结果显示各因素见交互作用不明显，确定最佳提取条件是乙醇浓度为65%，料液比为1 ∶20（g/mL），超声时间为30 min。该条件下所得样品，通过HPLC 色谱图对比可得样品中人参皂苷Ro 的提取率为74.6%，人参皂苷Rd 的提取率为87.1%。