响应面设计优化丽江海棠果果汁饮料配方

童观珍，樊莹润，李泽林，肖丽宏，付晓萍，范江平

（云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明650201）

海棠果富含丰富的黄酮和多糖等活性成分，具有抗衰老[1]、抗肿瘤[2]、抗氧化[3-4]等作用，其药用价值早在《本草纲目》就有记载：“酸甘平、无毒、治泄痢”[5]。海棠果果实中还含有丰富的常量营养物质和微量元素，其中粗蛋白占3.12%，是苹果、梨的1.5 倍，每100 g 果实含524.70 mg 氨基酸，其氨基酸组成中脯氨酸和天门冬氨酸的占比最大，分别为12.24 g/kg 和11.16 g/kg[6]；并且该果实中的粗纤维占7.48%，粗纤维作为人体不可吸收的膳食纤维，可加快人体的肠道蠕动和代谢，缓解现代人的便秘排毒症状；果实中的微量矿物元素钙、磷、锌、铁也大量存在[7]，因此对于海棠果的营养功能特性正引起科研人员的兴趣，并对此开展深入研究。目前对海棠果的加工利用已有果酒、果醋、果茶等产品[8-10]，也有从果实中提取天然红色素等工艺的探究[11]。丽江海棠果（Malus rockii Rehd.），是产自云南省丽江市的一种蔷薇科苹果属的果实[12]，是云南特有的野生资源，其未成熟果实较为酸涩，成熟后果实呈鲜红色，口感酸甜可口，细脆多汁深受当地居民喜爱，据当地居民介绍，有关节疼痛，儿童小便不畅时，都会食用丽江海棠果来得到缓解。在《中国纳西康巴医药学》中也能够找到关于丽江海棠果入药的证据。目前丽江海棠果消费方式主要是鲜食，其精深加工产品的开发利用还很少见报道。

Box-Behnken 设计简称BBD，是响应面试验设计的常用方法，通过多元二次方程拟合各因素与效应值的函数关系，对回归方程的分析来优化工艺，解决多种变量关系；比起正交试验，它可有效的，预测性更好的评价因变量和自变量之间的非线性关系[13]，在药物有效成分提取、食品加工中被广泛应用[14-16]。因此，本试验在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken 法优化丽江海棠果果汁饮料的配方条件，得出最佳的配方，以期为丽江海棠果的开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丽江海棠果：产自云南省丽江市玉龙县拉市乡，鲜果采摘后，运往云南农业大学畜产品加工工程中心-20 ℃冷库保存备用。白砂糖：耿马南华糖业有限公司；β-环糊精：郁南县永光环状糊精有限公司；柠檬酸：潍坊英轩实业有限公司；白砂糖、β-环糊精、柠檬酸均为食品级。

1.2 仪器与设备

T6 新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；HX-PB811 破壁机：佛山市海迅电器有限公司；HWS-24 电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；BS224S 电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；H3-18K 台式高速离心机：湖南可成仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

丽江海棠果果汁饮料加工工艺流程及操作要点：

1.3.1.1 丽江海棠果果汁的制备

选择无病无霉烂、新鲜成熟的海棠果果实清水洗净、去蒂，按料水比1 ∶3（g/mL）加入超纯水，倒入破壁机中破壁3 min，分别用200 目和400 目纱布2 次过滤分离的到澄清透明的海棠果果汁。

1.3.1.2 调配

按试验设计将一定比例的海棠果果汁与白砂糖、柠檬酸、β-环糊精混合，加水定容至所需体积，混匀后均质处理。

1.3.1.3 均质

为便于添加剂更均匀的分布在溶液中，同时提高成品的整体感官分值，需用均质机对饮料进行均质处理，采用20 MPa，均质两次为宜。

1.3.1.4 灭菌

为保证果汁中VC和花青素等营养物质不被破坏，采用沸水浴灭菌处理，饮料灌装封口后，95 ℃下灭菌20 min，室温25 ℃冷却或在4 ℃冷库冷却得到成品。

1.3.1.5 稳定性试验

将成品置于4 ℃冷库过夜，通过饮料的透光性来检测饮料的稳定效果。

1.3.2 感官评定方法

配比的优劣将从色泽、口感、香气、组织状态4 个方面对海棠果果汁进行整体感官评价，满分为100 分，其中口感和色泽各为30 分，香气和组织状态各为20分，选择10 名有食品专业背景的人员对成品进行感官评价，小组人员身体健康，无不良嗜好，味觉灵敏，在正式评定前进行相应指导，果汁的感官评定标准如表1。

表1 海棠果果汁饮料感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of Malus rockii Rehd.juice beverage

1.3.3 单因素试验设计

本试验以风味、口感、组织形态、香气4 个方面为评价指标进行单因素试验，选取原果汁添加量、白砂糖、柠檬酸、β-环糊精4 个因素进行单因素试验，每个因素取6 个水平，各因素水平分别为：果汁（40 %、50%、60%、70%、80%、90%），白砂糖（0%、2%、4%、6%、8%、10%），柠檬酸（0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%），β-环糊精（0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）。综合以上各因素对果汁的感官评价和透光率的影响。

1.3.4 透光率测定

将配置好的海棠果果汁在4 ℃冷库冷藏过夜，观察果汁的沉淀情况，后用高速离心机在转速为5 000 r/min条件下离心5 min，取上清用紫外分光光度计在625 nm处测定吸光度[17]，并以超纯水为参比，具体计算公式如（1）所示。

式中：A 为饮料的透过率；A0为超纯水的透过率。

1.3.5 丽江海棠果果汁配方优化

在单因素基础上，选择原果汁添加量、白砂糖、柠檬酸、β-环糊精四因素三水平，以感官分值为指标，采用Design-Expert8.0.6 软件的Box-Benhnken 响应面设计优化海棠果果汁饮料的配方，因素水平编码见表2。

表2 海棠果果汁响应面因素水平表Table 2 Response surface factors and levels of Malus rockii Rehd.juice

1.3.6 微生物指标测定

菌落总数的测定：参考GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》；大肠菌群的测定：参考GB 4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 原果汁添加量对海棠果果汁饮料品质的影响

海棠果原果汁呈鲜红色，且无明显沉淀，口感较为酸涩，因此原果汁量对饮料的整体感观有重要影响，考察果汁用量对海棠果果汁品质的影响，如图1 所示。

图1 原果汁添加量对海棠果果汁饮料品质的影响Fig.1 The effects of raw juice addition on the qualities of Malus rockii Rehd.juice beverage

由图1 可知，当果汁的添加量达到70%左右时，饮料的口感、色泽评价均较好，而低于此添加量时，则口感稍显寡淡，风味不足，颜色呈粉色，果汁添加量高于80%时，则过于酸涩，整体口感评分不高，其透光率因果汁的增加明显降低，原因在于果汁原有的天然红色素和能透过滤布的细小悬浮物的存在影响了整体的感官和透过率，这说明合适果汁的添加量对提高海棠果果汁感官品质有重要影响，原果汁中独特的风味物质使果汁的口感浓郁香气宜人，添加量过大时，酸度过高，且涩味严重，酸甜比失调，并且饮料中有机酸占比过大会使其整体感官分值降低，同时饮料中的单宁与蛋白质分子之间，蛋白质与色素会产生聚集而产生沉淀，最终使得饮料的组织状态和口感变差[18]，果汁中的总酸可与白砂糖形成适宜的糖酸比，同时考虑到经济成本，原果汁添加量在70%左右为宜。

2.1.2 白砂糖添加量对海棠果果汁饮料品质的影响

白砂糖添加量对海棠果果汁饮料品质的影响见图2。

图2 白砂糖添加量对海棠果果汁饮料品质的影响Fig.2 The effects of white sugar addition on the qualities of Malus rockii Rehd.juice beverage

海棠果中含有大量的有机酸及果糖，白砂糖可与果汁风味物质中的果糖产生味觉协同作用，合理的糖酸比例与饮料的口感密切相关，由图2 可知，白砂糖的添加对果汁透光率影响不大，白砂糖已较好的分散在果汁中，在饮料中加入不同比例的白砂糖，当添加量为8%时，海棠果饮料的综合感官品质最佳，与不添加白砂糖的组差值20 分，白砂糖添加量少和过多都对饮料的整体感官评分产生较大的影响，可能是适量的白砂糖可与果汁中的风味物质和甜味物质产生良好的协同作用，香味浓郁，甜味醇厚，但添加量过多时，白砂糖甜度太高过于突出且单一，掩盖了海棠果果汁原有的风味，同时酸甜比比例失调，整体口感变差。

2.1.3 柠檬酸添加量对海棠果果汁饮料品质的影响

果汁饮料生产加工过程中，常因酚类的存在使果汁氧化发生褐变，柠檬酸作为一种常用的果汁护色添加剂，通过降低果汁pH 值螯合金属离子，抑制氧化酶活性来达到护色效果，同时作为一种酸味调节剂在饮料产业中发挥重要作用[19-20]，柠檬酸添加量对海棠果果汁饮料品质的影响见图3。

图3 柠檬酸添加量对海棠果果汁饮料品质的影响Fig.3 The effects of citric acid addition on the qualities of Malus rockii Rehd.juice beverage

由图3 可知，当柠檬酸添加量为0.04 %时，可与白砂糖和果糖形成协调的糖酸比，饮料的感官分值相对更高，不添加或者添加过量都会影响整体的糖酸比，这说明柠檬酸的添加对整体感观有重大的影响。在其它类型的饮料工艺研究中，如刘雅在苹果火龙果复合饮料添加了2%的柠檬酸[21]，而吴鹏仅在荸荠果汁中添加0.1%的柠檬酸[22]，由此可知，不同品种的原料，柠檬酸添加量也不同。依照透光率来看，柠檬酸对海棠果汁透光率影响不大，有可能是放置时间较短，柠檬酸在护色效果上在不同组间的优势不显著。

2.1.4 β-环糊精添加量对海棠果果汁饮料品质的影响

海棠果原果汁口感较为苦涩，为改善口感，需要对果汁进行脱苦处理，需在果汁中加入β-环糊精，β-环糊精是直链淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，其脱苦机能在于可与苦味物质通过范德华力和氢键结合形成稳定的包嵌物，在溶液中十分稳定，可以在不影响果汁的营养成分情况下达到脱苦效果[23]；具有易溶于水，无毒，对热稳定等优良特性[24]，加上其成本低廉，在食品工业被广泛应用，β-环糊精添加量对海棠果果汁饮料品质的影响见图4。

图4 β-环糊精添加量对海棠果果汁饮料品质的影响Fig.4 The effects of β-cyclodextrin addition on the qualities of Malus rockii Rehd.juice beverage

由图4 可知，当β-环糊精添加量为0.2%时，品质较佳，比不添加综合感官评分高15 分，且对透光率影响不明显，可能是β-环糊精具有稳定、增溶的特性使得饮料中的微粒被包被，透明度增加[25]。饮料在较短时间内放置，β-环糊精的包埋作用使果汁无悬浮或沉淀现象产生，因此对于最终的透光率影响并不明显。

2.2 海棠果汁Box-Behnken 响应面结果与分析

Box-Benhnken 响应面优化结果见表3。

表3 海棠果果汁最佳配方响应面试验设计及结果Table 3 Response surface design arrangement and corresponding experimental result of Malus rockii Rehd.juice beverage

利用Box-Behnken 响应面对数据进行多元回归拟合，得到感官分值的二次多项回归方程为：感官分值Y=89.40+0.92A+0.75B+6.83C+4.00D-0.50AC-0.25 AD-0.25BD+2.00CD-5.33A2-5.33B2-9.45C2-8.20D2

海棠果果汁回归模型方差分析见表4。

由表4 可知该模型是极显著的（p＜0.000 1），各单因素中一次项C、D，交互项CD 二次项A2、B2、C2、D2高度显著的，一次项A 一般显著，其它均不显著，柠檬酸对海棠果果汁的感官评价影响最大，其次是β-环糊精，影响最小的是白砂糖，交互项CD 极显著说明柠檬酸和β-环糊精相互作用对果汁品质有显著影响，回归模型的决定系数为R2=0.986 9 说明该模型拟合度良好，可用此模型作为海棠果饮料工艺的分析和预测，该模型失拟项P=0.201 3＞0.05 说明失拟项不显著，用此模型来表明各因素和响应值的函数关系具有可靠性，各单因素对响应值的影响程度主次顺序为：柠檬酸＞β-环糊精＞原果汁添加量＞白砂糖。

表4 海棠果果汁回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of Malus rockii Rehd.juice beverage

柠檬酸和β-环糊精的交互作用的相应面和等高线见图5 和图6。

图5 交互项C 和D 影响海棠果果汁品质的响应面图Fig.5 Interaction surface C and D affects the response surface of Malus rockii Rehd.juice quality

图6 交互项C 和D 影响海棠果果汁品质的等高线图Fig.6 Interaction surface C and D affects the contour map of Malus rockii Rehd.juice quality

由图5 和图6 可知，响应面和等高线图都存在顶点，所选范围存在极值，等高线形状为椭圆形，说明柠檬酸和β-环糊精的交互作用显著，与方差分析结果基本一致。在响应面和等高线在描述柠檬酸和β-环糊精对感官分值的影响时，固定其中一个因素，感官分值随另外一个自变量的增大呈先增大后减小的趋势，规律与前期的单因素试验结果相近。

2.3 海棠果果汁饮料配方的确定

在各因素可选范围内，以感官分值为响应值，根据模型回归分析可得海棠果果汁的最佳配方为：原果汁添加量为72.20%，白砂糖添加量8.55%，柠檬酸添加量0.05%，β-环糊精添加量为0.24%，在此优化条件下海棠果果汁的理论综合分值为90.42 分，同时为验证该模型的可靠性，根据以上的条件做了3 组重复验证试验，所得最终评分为88.0、89.7、88.2，平均分为88.63，与模型预测分值接近，说明此次配方所得的成品在色泽、口感和组织状态均良好。

2.4 微生物指标测定结果

菌落总数＜100 CFU/mL；大肠菌群＜1 CFU/mL；符合GB 7101-2015《食品安全国家标准饮料》的标准。

3 结论

丽江海棠果原果汁添加量对感官分值和透光率都有显著的影响，透光率会随原果汁的增加而下降，果汁中沉淀率会增加，白砂糖、柠檬酸和β-环糊精对果汁的感官有较大的影响，原因在于柠檬酸和白砂糖可与果汁中糖分和可滴定酸形成协调的糖酸比，而β-环糊精则起到脱苦稳定作用。根据Box-Benhnken 响应面优化结果表明海棠果果汁的最佳配方为：原果汁添加量72.20%，白砂糖添加量8.55%，柠檬酸添加量0.05%，β-环糊精添加量0.24%，验证试验感官平均分值为88.63，与模型预测值接近，采用此模型配方得到的果汁颜色呈鲜红色，过夜后果汁依然澄清明亮，无明显沉淀，酸甜可口，果香味浓郁，同时营养成分得到了较好的保留。在该工艺条件下制得的丽江海棠果果汁饮料酸甜爽滑，改善了海棠果较为苦涩难以入口的问题，为将来丽江海棠果饮料市场和扩大消费人群提供了基础。