白藜芦醇通过激活PI3K/Akt通路抑制心肌梗死大鼠细胞线粒体凋亡的作用研究

张显纯 王 琳 杨 帆

心肌梗死患者缺血-再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)后出现的心肌细胞凋亡是引起心肌损伤的主要机制之一，线粒体凋亡途径的激活可诱导心肌细胞损伤，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)是调节缺氧或损伤下细胞凋亡的重要通路[1-2]。白藜芦醇是一种天然存在的多酚物质，近年来发现，白藜芦醇具有抑制心肌细胞凋亡和减少缺血后心肌细胞损伤的作用[3]。但是，关于其保护心肌细胞机制的研究较少，最新的临床研究发现联合白藜芦醇可提高对心肌梗死的治疗效果[4]。本研究旨在分析白藜芦醇通过抑制心肌梗死大鼠细胞凋亡的机制，为白藜芦醇应用于急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂、仪器和材料

选用45只成年SD大鼠(南京金陵医院)，雄性，220～250 g。ELISA试剂盒和TUNEL凋亡试剂盒(武汉华美公司)。Model 680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)。B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、细胞死亡调解子(Bcl-2 interacting mediator of cell death，BIM)、Bcl-2相关蛋白X(Bcl-2-associated X protein，BAX)、半胱天冬酶3(Caspase3)和半胱天冬酶9(Caspase9)引物由苏州Genewiz公司设计和合成。逆转录试剂盒TaKaRa和SYBR Prellix Ex TaqTM实时聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司。anti-PI3K，anti-Akt，anti-p-PI3K，anti-p-Akt以及相关二抗均购自美国Abcam公司。聚偏二氟乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美国Bio-Rad公司)。

1.2 建模及干预方法

将45只SD大鼠随机分为对照组、模型组和白藜芦醇组，每组15只。

(1)心肌梗死大鼠模型建立方法为:将大鼠使用4%的水合氯醛麻醉，气管插管(潮气量20 ml/kg，呼吸频率50次/min)并连接心电图，随后迅速打开胸腔暴露心脏，使用6/0线在左心耳下约2 mm处的冠状动脉前降支结扎，显示心电图QRS波增宽为结扎成功，45 min后取出丝线再灌注120 min，至心电图QRS波恢复，关闭并缝合。

(2)对照组大鼠仅打开胸腔，在冠状动脉前降支结扎前1 min舌静脉注射生理盐水。

(3)白藜芦醇组大鼠在冠状动脉前降支结扎前1 min经舌静脉注射白藜芦醇，剂量为20 mg/kg。术后采集小鼠静脉血以及心脏组织进行后续的研究。

1.3 实验方法

1.3.1 酶联免疫吸附法

通过检测大鼠心肌酶指标判断心肌细胞损伤情况。将血液静置后离心，以2000 r/min离心10 min，使用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测大鼠血清样本中肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB)水平。根据说明书加入酶标记试剂和显色剂，并通过加入终止溶液终止反应。

1.3.2 细胞凋亡与聚合酶链反应

(1)细胞凋亡。通过TUNEL凋亡试剂盒检测凋亡率，按照试剂盒说明书操作并在荧光显微镜下观察。

(2)实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative realtime-polymerase chain reaction，qRT-PCR)。qRTPCR法用于检测心肌组织中信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)水平，组织裂解后收集总mRNA，在95 ℃下激活DNA聚合酶5 min进行PCR，进行40个循环的95 ℃、10 s和60 ℃、30 s两步PCR，最终延伸75 ℃下10 min，保持在4 ℃，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内部参照物，使用比较循环阈值法(2-ΔΔCT)分析RNA水平。

1.3.3 免疫印迹(Western blot)法

取对数生长期的bcl-2细胞，按2×106个细胞/培养皿接种bcl-2细胞。加入含终浓度为2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L异土木香内酯的培养基培养细胞48 h，离心收集细胞，使用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤细胞后，加入上样缓冲液100 μl，剧烈振荡后冰浴下超声波处理1 min。100 ℃加热10 min使蛋白质变性，以12000 r/min离心10 min，取上清液测定蛋白浓度。取50 μg蛋白在SDS-PAGE电泳下分离，电转移至硝酸纤维膜，用5%脱脂奶粉于室温下摇动封闭膜2 h。弃封闭液，用1×TBS-T洗膜3次，每次15 min。膜在抗p53多克隆抗体(1∶500)和抗Bax多克隆抗体(1∶700)稀释液中室温过夜孵育，1×TBS-T洗膜15 min，共3次后，在二抗稀释液(抗鼠1∶5000)中孵育40 min。再次洗膜后加入增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂，反应1 min，用X光片曝光1～10 min后显影。

在液氮的保护下裂解组织，离心(12000 r/min，15 min)后收集上清液，使用10%的SDS-PAGE凝胶用于电泳，电泳后使用PVDF膜转膜并在室温下用5%无脂牛奶封闭2 h。加入一抗，室温振荡2 h，后在4 ℃孵育过夜，加入二抗。使用GAPDH作为内部参照物。

1.4 观察指标

(1)ELISA检测大鼠血清样本后，使用酶标仪检测并计算大鼠血清cTnT和CK-MB水平浓度。

(2)Western blot检测PI3K、p-PI3K、AKT以及p-AKT蛋白的水平，并计算p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的值，分析PI3K和AKT蛋白磷酸化水平。

(3)TUNEL凋亡试剂盒检测凋亡率，正常细胞的细胞核呈现蓝色荧光，凋亡细胞的细胞核颜色偏白并且呈聚集状态。

(4)观察白藜芦醇对线粒体凋亡相关蛋白，包括Bcl-2、BIM、BAX、Caspase3和Caspase9的mRNA水平的影响。

1.5 统计学方法

使用SPSS19软件对所有实验数据进行统计分析，计量资料以均值±标准偏差表示，通过单因素方差分析(ANOVA)检验组间差异，组间两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠心肌酶水平比较

模型组大鼠血清cTnT和CK-MB水平与对照组相比显著升高，其差异有统计学意义(t=34.587，t=24.987；P＜0.05)；白藜芦醇组大鼠血清cTnT 和CK-MB水平显著低于模型组，其差异有统计学意义(t=27.129，t=14.971；P＜0.05)，见表1。

表1 三组cTnT 和CK-MB水平比较

2.2 三组大鼠心肌细胞凋亡情况比较

模型组大鼠的心肌细胞凋亡率显著升高，与对照组比较差异有统计学意义(t=38.971，P＜0.05)；白藜芦醇组大鼠心肌细胞凋亡率显著低于模型组，其差异有统计学意义(t=12.687，P＜0.05)，见表2和图1。

表2 三组大鼠心肌细胞凋亡情况比较

图1 TUNEL法检测三组大鼠心肌细胞凋亡情况(×50)

2.3 白藜芦醇对p-PI3K/Akt通路的影响

建模后大鼠心肌细胞中的p-PI3K/PI3K通路被显著抑制，模型组与对照组相比和白藜芦醇组与模型组比较差异有统计学意义(t=21.927，t=16.541；P＜0.05)，而白藜芦醇可显著促进p-PAk/Akt通路活化，模型组与对照组比较和白藜芦醇组与模型组比较，差异有统计学意义(t=25.314，t=24.876；P＜0.05)，见表3和图2。

表3 白藜芦醇对大鼠心肌组织中PI3K/Akt通路的影响

表4 白藜芦醇对线粒体凋亡相关基因mRNA水平的影响

图2 Western blot检测各组大鼠心肌组织中PI3K/Akt通路相关蛋白的表达水平

2.4 白藜芦醇对线粒体凋亡相关基因mRNA水平的影响

建模后大鼠心肌细胞BIM、BAX、Caspase9以及Caspase3的mRNA水平上调，而Bcl-2mRNA水平下调，白藜芦醇可显著抑制BIM、BAX、Caspase9及Caspase3基因表达，并促进Bcl-2基因表达，见表4。

3 讨论

AMI是指由于冠状动脉急性缺血引起的心肌梗死，具有发病急、进展快等特点，具有极高的病死率，且预后差异大，对患者生活和生命造成极大威胁[5]。心肌梗死是最常见的急性心脏损伤的原因之一，虽然近年来对心肌梗死的治疗有所改善，然而心肌梗死后血液再灌注导致大量心肌细胞的缺血性死亡的情况仍难以缓解，因此减少I/R对心肌细胞的损伤在临床治疗心肌梗死和提高预后中具有重要意义[6]。

白藜芦醇具有多种生化和生理作用，包括抗血小板、抗氧化应激、抗凋亡和抗炎作用，并具有保护心肌细胞改善心脏功能的作用[7]。为进一步分析白藜芦醇对心肌I/R大鼠的影响，本研究建立了大鼠I/R模型，建模后大鼠血清中cTnT和CK-MB水平显著升高，提示建模后心肌细胞受到损伤，cTnT和CK-MB外流至外周血中，而白藜芦醇具有保护I/R后心肌细胞损伤的作用。进一步的分析显示建模后大鼠心肌细胞凋亡率显著升高，而白藜芦醇干预后可显著抑制心肌细胞凋亡。国内有研究显示，白藜芦醇可保护I/R后的心脏损伤[8]。林岩等[9]通过体外细胞实验也发现白藜芦醇可以抑制肾上腺素诱导的心肌细胞的凋亡，提示在体内或体外，白藜芦醇可以减少I/R后心肌细胞损伤抑制细胞凋亡的作用。

为进一步分析白藜芦醇抑制I/R后心肌细胞凋亡减轻心肌细胞损伤的机制，本研究分析了其对PI3K/Akt通路和线粒体凋亡相关基因表达水平。PI3K/Akt是调控细胞凋亡的重要通路，已有研究显示，在心肌细胞缺血或I/R后，PI3K/Akt通路被抑制，而线粒体凋亡可通过PI3K/Akt通路调节，参与I/R后心肌细胞凋亡[10-11]。本研究结果显示，建模后心肌细胞中的PI3K/Akt通路被显著抑制，而白藜芦醇可显著促进PI3K/Akt通路活化，白藜芦醇可显著抑制BIM、BAX、Caspase9及Caspase3基因表达并促进Bcl-2基因表达。Pei等[12]研究结果显示，提高PI3K/Akt通路具有保护心肌细胞损伤的作用。Colleen等[13]研究认为，PI3K/Akt途径是黄酮保护心肌细胞I/R损伤所必需的通路。Zhang等[14]报道，白藜芦醇具有上调PI3K/Akt途径的作用，Wu等[15]的研究也得到了相似的结果。黄新宇等[16]报道，白藜芦醇可通过上调Nrf2/ARE通路抑制心肌细胞I/R后炎性和氧化应激损伤。此外，也有研究显示，白藜芦醇还可通过其他方式保护心肌细胞[17]。提示白藜芦醇可能通过促进PI3K和Akt磷酸化抑制线粒体凋亡途径，但是关于白藜芦醇保护I/R的其他机制还需要进一步研究。

白藜芦醇通过激活PI3K/Akt通路抑制心肌梗死大鼠细胞线粒体凋亡，并减少I/R引起的心肌细胞损伤。然而，关于白藜芦醇治疗心肌梗死及I/R的效果和具体机制还需要进一步研究。