基于粪便DNA的贺兰山岩羊亲权鉴定和婚配制研究

祝招玲,刘振生,高 惠,张致荣,姚绪新,刘 鹏,韩兴志,王继飞,4,滕丽微,*

1 东北林业大学野生动物与自然保护地学院,哈尔滨 150040 2 佳木斯大学经济与管理学院,佳木斯 154007 3 国家林业局野生动物保护学重点开放实验室,哈尔滨 150040 4 宁夏贺兰山国家级自然保护区管理局,银川 750021

岩羊(Pseudoisnayaur)属偶蹄目牛科羊亚科岩羊属,是典型的高山动物,栖息于高原丘原和高山裸岩与山谷间的草地,被世界自然保护联盟物种生存委员会(IUCN/SSC)收录为低危种,在我国重点保护野生动物名录中,被列为国家二级保护动物。目前对岩羊的研究主要集中在种群生态学[1]、行为生态学[2]和种群遗传学[3]等领域。伴随着非损伤性取样技术的应用,利用粪便DNA结合微卫星标记对羊亚科动物进行个体识别、亲权鉴定和遗传多样性等方面开展了丰富的研究[4-5],同时对动物的婚配制也进行了一定的研究,如对倭黑猩猩(Panpaniscus)[6]、黑麂(Muntiacuscrinifrons)[7]、小麂(Muntiacusreevesi)[8]和黑犀牛(Dicerosbicornis)[9]等婚配制的研究,这使得分子生物学手段成为研究岩羊亲权鉴定和婚配制的新视角。

本研究采用非损伤性取样技术,通过微卫星标记进行个体识别和亲权鉴定,并分析雌雄岩羊的交配策略,探讨岩羊的婚配制度,为进一步开展岩羊种群分子行为学研究而完成基础性技术研发工作,同时也为该物种的保护、利用和管理提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 研究地概况及样本采集

本研究采样地点为贺兰山岩画风景区(N 38°44′,E 106°01′),位于贺兰山东麓,北起拜寺口,南至三关口,南北长30 km,东西宽4 km,海拔1448 m,是典型的大陆性气候特征,全年干旱少雨,年均降水量200—400 mm之间,年平均蒸发量2000 mm[1]。植被以山杨(Populusdavidiana)、灰榆(Ulmuspumila)、酸枣(Zizyphusjujubevar.spinosa)、冰草(Agropyroncristatum)、针茅(Stipacapillata)、早熟禾(Poaannua)等为主。此处岩羊数量较多,具有一定的代表性。在2017年7—8月和11—12月采用样线法进行岩羊新鲜粪便样本的采集,依据贺兰山实际沟道走向和地形地貌特征布设了7条样线,样线长度为2—6 km[10]。在样线行走过程中,搜寻岩羊的新鲜粪便,若发现岩羊实体,等待岩羊自行离开后,再进行新鲜粪便样本的收集。为了避免样本交叉污染,戴口罩和一次性PE手套,用已消毒的镊子采集粪便样本,在新鲜的粪便中选取20粒左右放入50 ml的管中,贴上标签,每采集完一次样本,更换PE手套和镊子。样本采集后带回实验室,放入-80℃冰箱保存。两次共获得369份岩羊粪便样本,岩羊皮张1份。

1.2 基因组DNA的提取和PCR扩增

1.2.1DNA提取和质量检测

岩羊粪便用试剂盒(QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit)提取DNA,岩羊皮张用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取DNA,按照说明书进行操作。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测岩羊粪便DNA质量。

1.2.2微卫星位点的选取和PCR扩增

本研究通过查阅文献得到31对贺兰山岩羊的微卫星位点[5,11-12],并委托生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon)合成引物,经多次实验后筛选出扩增稳定且多态信息含量高的10对引物(见表1),在上游引物5′端分别标记FAM、HEX、TAMRA三色荧光重新合成。PCR反应体系：总体积12 μL,2×PCR Buffer for KOD FX Neo 6 μL；2 mM dNTPs 2.4 μL；10 pmol/μL的上、下游引物各0.36 μL；100 ng/μL的DNA模板1.5 μL；1 U/50 μL KOD FX Neo 0.24 μL；ddH2O 1.14 μL。PCR反应程序：94℃预变性2 min,98℃变性10 s,54℃—60℃退火30 s,68℃延伸30 s,反应35个循环,最后68℃延伸7 min。

实验采用Huber等[13]提供的2对引物SRY12、BMCl009和牙釉蛋白基因PCR法[14]进行性别鉴定(见表2)。对实验的所有样本进行3次PCR 扩增,并用实验室已知性别的岩羊皮张DNA样本作为对照。性别鉴定多重PCR扩增：出现双条带(180 bp和300 bp)判定为雄性；出现一条带(300 bp)则判定为雌性。牙釉蛋白基因PCR扩增法：出现双条带(218 bp和263 bp)判定为雄性；出现一条带(263bp)则判定为雌性。最后比较两套PCR体系的结果来判断样本的性别。PCR反应体系同上。

表1 10对微卫星引物序列Table 1 Ten microsatellite primer sequences

表2 性别鉴定引物序列Table 2 Primer sequences of sex determination

1.3 数据分析

微卫星位点的扩增产物送上海生工用ABI测序测仪(3730xl DNA Analyzer)进行分型,用Excel整理微卫星数据,之后用Cervus 3.0[15](Allele Frequency Analysis)功能,计算等位基因数目、杂合度、多态信息含量、亲权排除概率、无效等位基因频率及Hardy-Weinberg平衡检测,同时对岩羊进行个体识别,鉴定个体时设定以下原则：所有微卫星座位上的基因型都相同或只有一个座位上的一个等位基因存在差异则为同一个个体[16]。运行Cervus 3.0的 Simulation of Parentage Analysis 和 Parentage A nalysis 功能,由于父本、母本均未知,所以将所有雄性和雌性分别作为候选父本和候选母本,取样概率均设为1.0(取样概率为候选父占取样中雄性比例及候选母占取样中雌性比例),其他选项均为系统默认值,进行亲权鉴定。实验中为了保证鉴定结果的准确性,所有位点全匹配的才确认亲子关系。使用Kingroup V2[17]计算个体间的亲缘系数(r),作为亲权鉴定的补充,亲缘系数范围在-1到1之间,表示亲缘相近的程度。理论上,当种群处于Hardy-Weinberg平衡时,0.5≤r<1时为同父同母的兄弟姐妹关系,0.25≤r<0.5时为同父异母或同母异父的兄弟姐妹关系[18]。通过Genepop[19]对10个位点组成的45组进行连锁不平衡检验,采用马尔科夫链法(Markov chain method)分析各位点间的连锁关系,参数均设为5000 dememorization、100 bateh和5000 iteration[20]得到无偏估计P值,当P<0.05表明连锁不平衡具有显著性。运用POPGENE 32[21]计算种群的近交系数Fis值,其值范围为-1—1,Fis值为显著正值时,表示种群内存在较严重的近交现象,Fis值为显著负值时,表示种群内存在远交[22]。

2 结果

2.1 个体识别和亲权鉴定

2.1.1基因组提取、性别鉴定和个体识别

369份岩羊粪便全部成功提取到DNA,经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,岩羊粪便中提取的DNA片段完整,质量较高,可以直接用于PCR扩增,共鉴定出282只岩羊个体,其中雄性152只,雌性130只。性别鉴定部分结果见图1、图2。

图1 岩羊SRY12和BMCl009位点的扩增结果Fig.1 The amplification results of SRY12 and BMCl009 loci of Pseudois nayaur1—9,13—17：岩羊粪便DNA；10：雌性岩羊皮张DNA；11：雄性岩羊皮张DNA；12：阴性对照

图2 牙釉蛋白基因(AMELX和AMELY)扩増结果Fig.2 The amplification results of amelogenin gene (AMELX &AMELY)1：雌性岩羊皮张DNA；2：雄性岩羊皮张DNA；3—12：岩羊粪便DNA；13：空白对照

2.1.2微卫星位点的亲权排除率

10个微卫星位点共检测到101个等位基因,平均等位基因(Na)为10.1,PIC在0.452—0.825之间,平均多态信息0.6129,为高度多态位点(PIC﹥0.5),平均观测杂合度(HObs)为0.7737,平均期望杂合度(HExp)为0.6512。Fis平均值为-0.1836。无效等位基因(F(Null))频率极低,平均值为-0.0790。Hardy-Weinberg平衡检测显示,8个位点完全符合哈温平衡,位点SRCRSP3和ILSTS011则显著偏离平衡。累积单亲排除概率为0.9615(累积单亲排除概率是根据多个位点累积排除任意一个可疑父亲或母亲为假父亲或假母亲的概率),累积双亲排除概率为0.9975(累积双亲排除概率是根据多个位点累积排除任意两个可疑父亲和母亲为假父亲和假母亲的概率)(见表3)。

通过Genepop对10个位点组成的45组进行连锁不平衡检验(见表4),由此得到11组连锁不平衡具有显著性的组合。经Bonferroni[23]校正后,仍连锁不平衡(P<0.05/45=0.0011)的组合有2组,PND01与INRABERN172,FCB48与PND05。

表3 10个微卫星位点的亲权排除概率Table 3 Parental exclusion probability of 10 microsatellite locis

Na：位点等位基因数,allele number of 1oci；HObs：位点观测杂合度,observed heterozygosity；HExp：位点期望杂合度,Expected heterozygosity；PIC：位点多态信息含量,Polymorphic information content；NE-1P：第1个亲本非排除概率,Combined non-exclusion probability (first parent)；NE-2P：第2个亲本非排除概率,Combined non-exclusion probability (second parent)；NE-PP：双亲非排除概率,Combined non-exclusion probability (parent pair)；Fis：近交系数的F-统计量检测值,inbreeding coefficient withF-statistics；HW：哈迪温伯格平衡Hardy-Weinberg equilibrium；F(Null)：无效等位基因频率,frequency with null；NS：不显著偏离,no significant deviation

表4 10个微卫星位点的连锁不平衡检验结果Table 4 Linkage disequilibrium test result of 10 microsatellites locis

图3 微卫星位点数与累积排除率之间的关系Fig.3 Relationship between the combined probability of exclusion and the number of microsatellite lociCE-1P,CE-2P,CE-PP：PIC由低到高排列的累积排除概率；CE-1P-1,CE-2P-1,CE-PP-1：PIC由高到低排列的累积排除概率

按照多态信息含量(PIC)由低到高和由高到低的顺序依次增加微卫星位点数进行累积排除率分析,结果由图3可知,随着微卫星位点数的增加,累积排除率逐渐增加,当微卫星位点达到7个(PIC由高到低)和9个(PIC由低到高)时,累积亲权排除概率大于0.9900,说明所筛选的10个微卫星卫点能进行准确的亲权判定。

2.1.3亲权鉴定

运用 Cervus3.0 软件的Parent pair(Sexes known)功能进行亲权鉴定,共鉴定出父-母-子7对,父-子21对,母-子19对。28对父-子的亲缘系数(r)在0.5000—0.8462之间,26对母-子的亲缘系数(r)在0.5000—0.8000之间,所有父子间、母子间、同父同母个体间的亲缘系数平均分别为0.6164、0.6251和0.5426。实验中运用10个微卫星位点进行亲子鉴定,亲权排除概率为99.75%。

2.2 婚配制度

由表5、表6可知,X162(♂)、X173(♂)各自3个后代间的亲缘系数在0.25≤r<0.5之间,说明X162(♂)、X173(♂)均与3个雌性交配过；D31(♀)、D33(♀)、D18(♀)、X168(♀)、D148(♀)各自后代间的亲缘系数在0.5≤r<1之间,说明它们只与1个雄性交配过；D73(♀)、D78(♀)、D89(♀)各自后代间的亲缘系数在0.25≤r<0.5之间,说明它们与2个雄性交配过；X163(♂)、X3(♂)、D145(♂)、X160(♂)、X112(♂)、D15(♂)各自后代间的亲缘系数在0.25≤r<0.5之间,说明它们与2个雌交配过；D45(♂)、D70(♂)各自后代间的亲缘系数在0.5≤r<1之间,说明它们只与1个雌性交配过。研究中多次出现1个雄性与2个或2个以上的雌性交配并产下后代,可知岩羊的婚配制属于一雄多雌。

表5 岩羊的亲子关系和亲缘系数Table 5 The coefficient of parentage and genetic relationship in Pseudois nayaur

表6 后代之间的亲缘系数Table 6 The relationship coefficient among the offsprings

3 讨论

3.1 亲权鉴定

目前普遍采用STR来鉴定个体间的亲权关系,其排除非亲本能力依赖于微卫星位点数和等位基因的多样性[24]。一般8—10个及以上微卫星位点即可确定较高的亲权鉴定准确率[15]。本研究选用10个高度多态性(PIC>0.5)微卫星位点(见表3),进行亲权鉴定是可行的。

无效等位基因是影响亲权鉴定准确性的基础因素,本研究使用的10个微卫星位点,杂合子丰富,无效等位基因频率极低,而Cervus3.0软件使用似然率(似然率即某一可疑父亲的似然值相对于理想父亲似然值的比)容许这些错误的存在,在统计处理上可以有效降低错配的敏感性,使亲权鉴定结果更加科学化,同时还可以充分使用所占有的遗传资料[25-26]。Hardy-Weinberg平衡检验结果发现共有2个微卫星位点出现偏离平衡的现象,其余8个位点处于平衡状态,Cervus 中一两个座位的Hardy-Weinberg不平衡并不影响亲权分析中似然比的计算。Fis为负值,说明种群内不存在近交。贺兰山岩羊是生活在特殊环境下的一个边缘种群,集小群,随着季节的变化,其集群类型、集群大小均会发生一定的变化,这种边缘种群在适应性进化过程中可能会导致不平衡选择,使得基因组中的某些位点偏离Hardy-Weinberg平衡[5]。10个位点经校正后有2组连锁不平衡具有显著性,可能是因为无效等位基因的存在导致了这些组合连锁不平衡。

一般情况下,参照国际常用标准,RCP>95%,倾向有亲子关系；RCP>99.73%,认定有亲子关系[25]；对于人类的亲权判定,累积排除概率99.0%—99.8%即可认定为极其成立的亲子关系[27]；王跃峰利用5个微卫星位点对白头叶猴进行个体识别和亲缘鉴定,得到累积非父排除概率为99.70%[28]；程文科对144头猪进行个体亲子鉴定时得到累积非父排除率为98.35%,与系谱记录结果完全相同[4]；郭立平利用8个微卫星位点在3种情况下为西门塔尔牛进行亲子鉴定,累积排除概率分别为99%、99.95%和99.99%,鉴定结果与系谱一致[29]。

实验中亲权排除概率为99.75%,并用Kingroup V2确定亲缘系数,进一步验证了亲权鉴定的准确性。因此,实验中采用的10对微卫星位点完全可以达到亲子鉴定的要求。

3.2 岩羊的婚配制度

陈小南[7]用70个黑麂个体粪便样本、任鹏[8]用177个小麂个体粪便样本、Garnier[9]用35只野生黑犀牛的粪便样本在亲权鉴定的基础上,通过分析雌雄间的交配关系确定婚配制。本研究利用282只岩羊个体粪便样本,根据岩羊雌雄间的交配关系研究婚配制度,在样本数量上完全满足实验要求。

通常把婚配制度分为单配制(monogamy)和多配制(polygamy),多配制又包括一雄多雌(polygyny)、一雌多雄(polyandry)和混交制(promiscuity),动物选择哪一种婚配制度受个体之间的相互作用和对外界环境适应的影响[30]。研究动物的婚配制度,需要注意在一个繁殖季节里,个体以什么样的方式获得配偶,获得配偶的数量以及雌雄个体的育幼行为等因素[31]。

新疆天山北山羊(Caprasibirica)倾向于组成“一雄多雌”的小群完成交配[32]。捻角山羊(Caprafalconeri)是一雄多雌的交配系统[33]。赤羊(Ovisvignei)在交配时期,雄性赤羊会由独居转为与4—5头雌性赤羊居住,是一雄多雌的交配系统[33]。盘羊(Ovisammon)在交配期间,活动区域选择地势平坦、避风暖和的低海拔区域,雄羊和雌羊开始集群,5—6 只雄盘羊和数十只雌盘羊一起活动,雄性盘羊间争偶激烈,相互剧烈格斗,胜者获取这群盘羊的交配权,交配季节结束后,雌雄又分开活动[34]。叉角羚(Antilocapraamericana)在交配季节占据了不设防的领地,雄性保护雌性的后宫[35]。阿尔卑斯羱羊(Capraibex)似乎能够通过坚持它们之间预先建立的稳定的优势关系来减少因争斗而消耗的能量,年长的雄性通常采取抚育策略垄断与雌性交配的机会,而年轻的、处于从属地位的雄性通过悄悄接近雌性的策略获得交配,但成功率总体上较低[36]。贺兰山岩羊集小群,发情期雌雄群、混合群和独羊比例显著上升,雌性岩羊相对分散,部分雄性岩羊在不同群之间迁移寻找发情的雌性岩羊,并通过争斗获得优势地位,进一步获得交配权,尽可能增加繁殖机会[37],这一现象说明了实验中1只雌性与2只雄性岩羊交配并产下后代的现象是在雌性不同的繁殖期之间,同时也证实了实验中1只雄性与多只雌性岩羊交配并产下后代的结果,推测岩羊是一雄多雌的婚配制度。

哺乳动物具有较长的妊娠期和哺乳期,雄性动物在此期间不能提供更多的帮助,而是倾向于尽可能多地与多个雌性交配,这是提高自身适合度的一种进化选择[38]。岩羊发情交配期在每年的11月末到12月,在12月中旬时达到高峰,母羊经过大约160 d的妊娠期后在次年5月中旬到6月中旬产仔,哺乳期3个月[39],这期间雄性岩羊不参与育幼活动,由雌性岩羊哺育下一代,观察发现母仔群出现的频率在一年的四个季节中均最高[10]。由于岩羊雌雄两性在婚配中投资的不平衡性,促使雄性岩羊有更多的时间和精力参与到繁殖行为中,获得与更多雌性交配的机会,这也验证了实验研究的结果,雄性岩羊与多个雌性岩羊交配并产下后代,表明岩羊是一雄多雌制的婚配制度。

实验从分子生物学角度对贺兰山岩羊进行亲权鉴定和婚配制研究,填补了这一领域的研究空白,并为进一步开展岩羊种群分子行为学研究积累基础资料。同时对采用非损伤性取样技术研究有蹄类动物的个体识别、性别鉴定、亲权鉴定和婚配制等具有重要意义,特别是对濒危有蹄类动物的保护和利用提供了新的研究方法和视角。此外,希望通过实验的研究成果,可以为有关部门和科研单位提供有效数据,促进形成一套更加完整的贺兰山岩羊保护、利用和管理体系。

致谢：宁夏贺兰山国家级自然保护区管理局胡天华高级工程师在野外调查中给予帮助,特此致谢。