超声弹性成像、超声造影技术评估门静脉压力的动物实验研究

杜婷婷，李军*，曹春莉，陈铭，徐丽红，马婷，王甲嘉，葛肖艳，刘闪闪，童瑾

(1 石河子大学医学院第一附属医院超声科,新疆 石河子832008;2 石河子大学医学院第一附属医院消化内科,新疆 石河子832008;3 石河子大学医学院第一附属医院普外科，新疆 石河子832008)

慢性肝脏疾病是严重危害人类健康的常见病，可引起持续、反复的肝实质炎症以及坏死，使肝脏内弥漫性细胞外基质过度沉积而降解不足进而形成肝纤维化[1-2]。门静脉压随着肝硬化程度的加重而增加、升高。肝静脉压力梯度(Hepatic Venous Pressure Gradient，HVPG)、术中游离门静脉压(Free Portal Pressure，FPP)是公认的评价门静脉压力的可靠指标[3]，但是HVPG及 FPP 的检测具有侵入性，对患者的要求较高，很难在临床大规模应用，尤其是偏远地区。因此非侵入性、简单易行、诊断效能高的门静脉压力评估方法成为近年的研究的热点。

声脉冲辐射力弹性成像(Acoustic Radiation Force Impulse Elastography，ARFI)[4-6]作为一种新的弹性成像技术，它通过测量感兴趣区(Region of Interest,ROI)的剪切波速度(Shear Wave Velocities,SWV)来评估组织弹性，即组织的硬度或质地，已广泛应用腹部及浅表器官疾病的定性诊断。超声造影(Contrast Enhanced Ultrasound，CEUS)在超声医学中占有重要的地位，可以清楚地显示组织微小血管内的血流灌注，增加图像的可分辨清晰度，增加超声病变检出率及对慢性肝病发生纤维化诊断的敏感性和特异性[7-8]。

本研究构建了不同程度的兔肝纤维化模型，进行ARFI和CEUS检查，将此两种方法获得的影像学参数与所测FPP进行对照研究，研究各参数与FPP的相关性，寻找能较准确评价FPP的参数，并获取该参数的截断值，为临床诊断及治疗PHT提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 兔肝纤维化模型的建立方法

选用健康新西兰大白兔44只，随机抽取8只作为对照组，背部皮下注射0.9%氯化钠溶液，剩余36只作为实验组，背部皮下注射纯CCl4，2次/周，共16周，起始剂量为0.3 mL/kg，3周后增加剂量为0.4 mL/kg，5周后增加剂量为0.5 mL/kg，此后维持剂量在0.5 mL/kg。

1.2 声脉冲辐射力弹性成像技术(ARFI)检测活体及离体兔肝硬度的方法

活体兔声脉冲辐射力弹性成像技术(ARFI)检测使用西门子公司生产的Acuson S 2000彩色多普勒超声诊断仪，9 L4探头，频率4～9 MHz，配置VTQ定量分析系统，探查深度0.5～4 cm，于第一次造模后第4、6、8、10、12、14周，分别从实验组随机选取3～6只新西兰大白兔，对照组随机选取1只，第16周处死剩余实验组及对照组兔，所有需行检查的兔当日禁食水、空腹8 h，8%水合氯醛盐溶液2 mL/kg耳缘静脉缓慢推注进行麻醉。麻醉后进行固定，充分暴露其腹部送至腹部彩超室接受检查。由同1名高年资超声医师对所有受试兔进行常规超声检查及ARFI检查，记录肝脏大小、边缘状态、实质回声、肝动脉、门静脉、肝静脉的血流方向及速度等情况，在二维超声的基础上，采用ARFI技术检测兔肝脏横向剪切波速度SWV(m/s)。待兔门静脉压力测量完成后，利用空气栓塞法处死实验兔，并快速结扎兔肝脏血管及周围韧带并游离出兔肝脏，然后取出兔肝进行ARFI检测，离体兔肝剪切波速度记为SWV1，感兴趣区域(ROI)的选择应避开肝内管道系统，取样深度为0.5～2 cm，检测10次，最后取平均值。

1.3 超声造影技术(CEUS)检测兔肝血流动力学方法

使用日立Ascendus(日本Hitachi公司)超声诊断仪，L52线振探头(频率3～7 MHz)，造影软件为EZU-CH9，造影剂采用SonoVue。

全部声学造影检测为具备10年以上工作经验的腹部超声医生完成，ARFI检查结束后，先行常规二维超声及彩色多普勒超声检查，在兔肝脏寻找一个能同时包含有肝动脉、肝静脉及门静脉的切面并开启造影模式，在开始注射造影剂的同时开始录像并计时，持续录像3 min。将感兴趣区域(ROI)放在兔肝实质、门静脉、肝静脉以及肝动脉上。对于血管，始终使ROI保持在血管结构内，对于肝实质，放置在距离超声探头1～4 cm的深度，同时避开肝内管道结构。

超声造影录像中前5 s的平均值被定义为基线强度。肝静脉到达时间(HVAT)、肝动脉到达时间(HAAT)、门静脉到达时间(PVAT)被定义为相应ROI内注射时间点至强度达到基线值的10%以上的时间间隔[7]。

PSI是肝实质达峰强度与基础强度的差值。PV-HAAT(即PVAT减去HAAT所得值)、HV-HAAT(即HVAT减去HAAT所得值)被计算出以减少人为以及血液循环时间不同所造成的影响。超声造影分析的主要方法如图1所示。

A—造影基础图像； B—造影剂到达肝动脉图像(箭头);C—造影剂到达门静脉图像(箭头);D—造影剂到达肝静脉图像(箭头)图1 肝纤维化F3期兔的超声造影图(肝动脉、门静脉和肝静脉到达时间分别为4、5、7秒)Fig.1 The arrival time of hepatic artery(portal vein and hepatic vein was 4 seconds,5 seconds,7 seconds for New Zealand rabbit of cirrhosis,respectively)

1.4 兔术中游离门静脉压力(FPP)测量方法

兔完成CEUS检测后，消毒后经上腹部肋骨下缘切口进腹，游离韧带后选择一支较粗的大网膜上的静脉进行FPP测量，充分暴露并游离好该静脉，然后将一根静脉输液管内注满生理盐水并与静脉留置针相连，同时夹闭输液管末端，将静脉留置针刺入已游离好的静脉并进行固定，将输液管垂直提起，并开放输液管的末端，至输液管中液体自然下落并处于稳定状态时，选取腰椎前缘水平为“0”点，进行液面高度测量，所测量的高度值就是门静脉自由压(cmH2O)。

1.5 兔肝纤维化病理分期诊断方法

兔Masson染色后的切片均由病理科主治医师及以上职称的医生独立盲法阅片诊断，分期标准依据Metavir分期法[9](2000年全国病毒性肝炎病理诊断标准)。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行数据分析。不同肝纤维化病理分期组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，各组均数间的比较采用最小显著差值法(Least-Significant Difference，LSD)。采用Spearman相关、Pearson相关性分析检验SWV、SWV1、HVAT、HV-HAAT与LF病理分期以及FPP的相关性。。利用曲线下面积(Area Under the Curve，AUC)验证ARFI技术和CEUS技术参数诊断门静脉压力的效果。以P<0.05为统计学检验水准。

2 结果

2.1 兔肝纤维化病理学分期结果

病理检查结果示：对照组兔肝脏病理学检查均正常；36只实验组最终造模成功32只，肝纤维化分期为F1期6只、F2期10只、F3期8只、F4期8只，伴有或不伴炎症坏死，造模成功率为88.89%(32/36)，各分期病理如图2所示。

A—对照组；B—F1期；C—F2期；D—F3期；E—F4期；Masson染色(×40)图2 兔肝纤维化病理分期Masson染色病理表现(×40)Fig.2 Pathological fibrosis staging in rabbits’liver tissue by Masson staining with a magnification(×40)

2.2 声脉冲辐射力弹性成像技术(ARFI)评估兔门静脉压力结果

实验组及对照组的肝纤维化各分期弹性参数SWV、SWV1检测结果见表1，各组间弹性参数比较，差异均有统计学意义(P均<0.001)(表1)。

表1 兔纤维化各分期弹性参数(SWV、SWV1)组间比较结果Tab.1 The value of SWV and SWV1 in different stages of liver fibrosis

注：a、b、c、d、e分别表示与对照组、实验组F1期、F2期、F3期、F4期比较，差异有统计学意义，P<0.05。

与肝纤维化病理分期及实际所测门静脉压力值为标准进行对照，研究弹性成像参数对于判断肝纤维化程度及门静脉压力的相关性。各纤维化分期FPP测量所得值差异均有统计学意义(P<0.05)(图3)。

注：a、b、c、d分别表示与对照组、实验组F1期、F2期、F3期比较，差异有统计学意义，P<0.05。图3 各纤维化病理分期兔游离门静脉压的比较Fig.3 The copmparison of FPP in different stages of liver fibrosis

Spearman相关分析显示SWV、SWV1、FPP均与LF分期相关，相关系数分别为0.935、0.921、0.940(P<0.001)(表2)。SWV、SWV1与FPP的Pearson相关系数分别为0.857、0.947，均有统计学意义(P<0.001)(表2)。FPP和SWV、SWV1的线性相关关系(图4)。

表2 SWV、SWV1、HVAT、HV-HAAT、LF分期与FPP的相关性Tab.2 The correlation among the SWV,SWV1,HVAT,HV-HAAT,stages of LF and FPP

注：*表示采用Spearman相关系数分析。

图4 SWV、SWV1与FPP之间相关性的散点图Fig.4 The scatter plot of the SWV,SWV1 and FPP

2.3 超声造影技术(CEUS)评估兔门静脉压力结果

应用CEUS技术，通过监测造影剂在肝内的循环时间获取肝脏血流动力学参数：肝动脉灌注时间、门静脉灌注时间、肝静脉灌注时间、肝实质峰值强度等。本次研究共记录并分析了HVAT、HV-HAAT、HAAT、PAVT、PSI等超声造影参数，结果可见不同纤维化程度组间HVAT、 HV-HAAT 参数差异有统计学意义(P均<0.001)，而HAAT、PVAT未见差异(表3)。与肝纤维化病理分期及实际所测门静脉压力值为标准进行对照，研究造影参数对于判断门静脉压力的相关性。Spearman相关分析显示HVAT、HV-HAAT与LF分期相关，相关系数分别为0.986、-0.842(P<0.001)(表2)。HVAT、HV-HAAT与FPP的Pearson相关系数分别为-0.587、-0.652，均有统计学意义(P<0.001)，(表2)。FPP和HVAT、HV-HAAT的线性相关关系如图5所示。

表3 不同肝纤维化程度兔的CEUS参数比较Tab.3 The comparison of CEUS parameters of different liver fibrosis degree

注：a、b、c、d、e分别表示与对照组、实验组F1期、F2期、F3期、F4期比较，差异有统计学意义，P<0.05。

图5 HVAT、HV-HAAT与FPP之间相关性的散点图Fig.5 The scatter plot of the HVAT,HV-HAAT and FPP

3 讨论

PHT是慢性肝脏疾病和肝硬化的一个严重并发症，肝病患者门静脉压力的改变常常伴随着较多异常的临床表现。因此，准确评估PHT对评估患者疾病状态和预后至关重要[10-11]，肝静脉压力梯度(HVPG)、术中游离门静脉压(FPP)的测量是评价门脉高压是否存在和严重程度的金标准，但HVPG的测量并不是在所有的中心都可以开展，而且这种技术是侵入性的，有些患者并不愿意接受。更为重要的，临床上需要用可重复的检测方法来监测疗效。ARFI技术可以用于肝脏硬度参数SWV和SWV1的测量，CEUS技术可以用于肝血管和肝组织的血流灌注参数的测量。因此，探讨ARFI、CEUS技术评价门静脉压力具有一定的临床意义。

本研究结果显示新西兰大白兔经ARFI技术检测弹性参数SWV与肝纤维化程度正相关(P<0.001)。在超声造影中，随着肝纤维化的加重，仅HVAT、HV-HAAT两个参数在评价肝硬化(F=4)时差异有统计学意义(P<0.05)，且随着肝纤维化的加重逐渐减少，其余参数(HAAT、PVAT、PSI)在本次研究中未发现统计学差异。HVAT、HV-HAAT发生变化的主要理论基础是肝纤维化过程中假小叶形成以及门静脉的压力增高，由于动静脉分流和毛细血管动脉化，导致HV-HAAT在严重纤维化(F≥3)时明显缩短。Augustin等[12]报道，随着肝纤维化的加剧，门静脉压力越来越高，肝脏硬度也逐渐增大。有研究表明，慢性肝病患者的门静脉高压的严重程度与一些CEUS参数密切相关，如HVAT、HV-HAAT[13-14]，提示CEUS可能用于门静脉压力的评估。本次研究通过分析上述参数与FPP的相关性，旨在寻找可以有效、无创监测肝纤维化过程中患者门静脉压力的新方法。本次实验采用导管法测量兔FPP，结果表明，虽然病理纤维化分期组间FPP仅在F4期与其他各期时间有统计学差异，但是可以看出随着肝纤维化的加重，FPP也逐渐增大。这与Zhai L等[15]一项关于CEUS技术评估犬肝纤维化过程中门静脉压力改变的研究结果相似。本研究进一步验证了SWV、SWV1、HVAT、HV-HAAT及LF分期与FPP均具有相关性(r=0.857、0.947、-0.587、-0.652、0.940，P均<0.001)，随着SWV、SWV1的增高，FPP逐渐增加，提示肝脏质地变硬，剪切波传播速度变快；而随着HVAT、HV-HATT的增高，FPP呈现逐渐减小的趋势。

综上所述，弹性成像ARFI技术、超声造影技术参数与兔门静脉压力具有较好的相关性，是评价兔门脉高压的潜在技术。