NCOA1和RBP4基因多态性与大白猪繁殖性能的关联分析

王斌虎，邱梅玉，赵玉强，谢苏，孙晓梅，来红霞，黄涛*

(1 石河子大学动物科技学院,新疆 石河子 832003;2 新疆正大食品有限公司,新疆 五家渠 831301)

我国是生猪养殖和猪肉消费第一大国。在现代养猪生产中，母猪繁殖性能是决定猪场经济效益的重要因素。大量的研究表明，猪的繁殖性状是受主效基因和微效多基因的共同调控的低遗传力经济性状，采用常规育种进展缓慢。而运用分子标记辅助选择可以提高选种的准确性，并加快选育进程。

NCOA1(核受体辅激活因子1)，又称为类固醇受体辅激活蛋白1基因，能够影响黄体的产生，为影响繁殖性能的“关键因子”，其转录活性可调控雄激素受体和雌激素受体的表达[1]。NCOA1基因在卵巢、垂体、肝脏和肺中高表达，而在背最长肌中低表达[2]，并调控子宫的发育过程[3-4]。王珊等[5]利用全基因组关联分析挖掘与绵羊繁殖性状显著相关SNPs,其中部分SNP位于NCOA1基因内部。猪的NCOA1基因位于3号染色体上，大量研究表明该基因存在三种形式的单核苷酸(TT、TC、CC)，并且其多态性可能对母猪的繁殖性能产生影响。

RBP4(视黄醇结合蛋白4)是孕期母体分泌的重要蛋白之一,其含量在囊胚扩张时期迅速升高,对胚胎的存活至关重要，其基因的多态性与产仔数密切相关[6-7]。RBP4基因能够影响精子和卵子产生、胚胎着床、胎盘发育、胎儿生长与发育,对子宫腔相应组织靶细胞发挥调控作用[8]。翟腾蛟等[9]对大白猪和长白猪群体的RBP4基因进行研究，发现此基因存在多态性，且对产仔数、初生窝重等性状具有显著影响。

大白猪是世界范围内使用最为广泛的纯种母猪，其繁殖性能对养猪业极其重要。尽管已有研究发现NCOA1和RBP4基因可能对母猪繁殖性能产生影响[10]，但由于以往研究报道结果不尽相同，同时缺乏针对大白母猪的相关研究，因此本试验探究了NCOA1和RBP4对大白母猪繁殖性能的影响，以期为大白猪的遗传选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

耳组织样和繁殖数据均来自新疆正大，包括在2014—2016年期间685头母猪(大白)的分娩日期数据、胎次数据、繁殖性状数据。繁殖性状的主要指标有总产仔数(TNB)、总活仔数(NBA)、健仔数(NHB)、死胎、木乃伊胎以及其初生窝重，其中初产685胎，经产2 164胎，共计2 849胎。

1.2 主要试剂、仪器

试验仪器包括TC-4000 PCR仪、微波炉、水平电泳槽、台式高速冷冻离心机、GelDocTM XR电泳凝胶成像系统。试剂包括组织基因组DNA抽提试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖、DNA限制性内切酶RsaⅠ、DNA 限制性内切酶MspⅠ(TaKaRa)、Marker DL500。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA的提取

切取猪耳组织样少许，于透明EP管中剪碎，遵循DNA提取试剂盒内提供的使用说明书进行提取，分别利用琼脂糖凝胶和紫外分光光度计检测其DNA的纯度和浓度，稀释至50 ng/μL于-20 ℃保存，用于后续研究。

1.3.2 引物设计

通过Premier5设计所需目标基因片段的上下游引物，由上海生工技术公司合成(表1)。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.3.3 PCR扩增

反应体系(20 μL)：2×Es TaqMaster Mix 10 μL，去离子水7.4 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物各0.8 μL。NCOA1目的片段扩增条件：94 ℃预变性4 min，循环35次(94 ℃变性30 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s)，72 ℃ 延伸 5 min，4 ℃保存1 h；RBP4仅退火温度变为56 ℃，其余反应条件同NCOA1。

1.3.4 PCR-RFLP检测

分别用RsaⅠ、MspⅠ对检测合格的PCR产物进行酶切反应。RFLP反应体系：DNA扩增产物12 μL，10×Buffer 1.5 μL，限制性内切酶0.5 μL，37 ℃水浴4 h，酶切产物分别采用4.0 %、2.0 % 的琼脂糖凝胶电泳进行检测，并利用凝胶成像系统拍照，根据片段形态判断基因型。

1.4 统计分析

统计NCOA1、RBP4的基因型，计算其相应的基因型频率、多态信息含量(PIC)、遗传纯合度(Ho)、遗传杂合度(He)、有效等位基因数(NE)，并进行H-W检验。

本试验建立的统计分析模型(最小二乘法分析)：yijkl=μ+Bi+Sj+Gk+eijkl。其中y为繁殖性状(TNB、NBA、NHB)的观察值，μ为群体的均值，Bi为胎次效应(初产、经产分别作为胎次效应1、2)，Sj为季节效应(年度的1～3月份、4～6月份、7～9月份、10～12月份分别作为季节效应1、2、3、4)，Gk为年度效应(2014、2015、2016分别作为年度效应1、2、3)，eijkl为随机残差。利用SAS(Version 9.2)软件分别对试验猪群多态位点的单基因型、合并基因型与繁殖性状进行关联性分析。

2 结果与分析

2.1 NCOA1和RBP4基因基因多态性检测结果

NCOA1的多态性位点位于该基因DNA正链的1 863 bp～2 302 bp处，长度为440 bp的PCR产物经酶切反应后，用基因型检测凝胶电泳(2.0 % 的琼脂糖)得到3种带型(图1)：440 bp(AA型)、440/282/158 bp(AB型)、282/158 bp(BB型)。

M：DNA Marker；1/3/4/5/6/8/9/10/12/13：AA基因型；2/7：AB基因型；11：BB基因型图1 NCOA1基因扩增产物 PCR-RFLP 电泳图Fig.1 NCOA1gene amplification product PCR-RFLP electropherogram

RBP4的多态性位点位于该基因DNA正链的600 bp～1 164 bp处，长度为565 bp的PCR产物经酶切反应后，用基因型检测凝胶电泳(4.0 % 的琼脂糖)得到3种带型(图2)：190/154/136 bp AA型)、190/154/136/125/29 bp(AB型)、190/136/125/29 bp(BB型)。

M：DNA Marker；9/11：AA基因型；5/6/7/13:AB基因型；1-4/8/10/12：BB基因型图2 RBP4基因扩增产物 PCR-RFLP 电泳图Fig.2 RBP4gene amplification product PCR-RFLP electropherogram

2.2 NCOA1和RBP4基因多态性频率分布

在试验母猪群体中，NCOA1检测到AA、AB和BB 3种基因型，其中AA型为优势基因型,A为优势等位基因，群体处于Hardy-Weinberg平衡状态(表2)。RBP4检测到AA、AB和BB 3种基因型，BB型为优势基因型，B为优势基因，其群体处于Hardy-Weinberg非平衡状态，其原因可能是在育种过程中对RBP4基因进行了选择。

表2 群体遗传学分析Tab.2 Population genetic analysis

注：Ho为纯合度，He为杂合度，NE为有效等位基因，PIC为多态性信息含量；PIC>0.5为高度多态，0.25

2.3 NCOA1和RBP4基因的遗传效应

分别计算了NCOA1基因和RBP4基因的显性效应、加性效应、显性度，以及每个等位基因的效应(表3)。

NCOA1基因的总产仔数、总活仔数、健仔数的显性效应和加性效应在经产猪中均为正值，RBP4基因相反；RBP4基因在经产猪群中A基因效应均表现为正值，B基因效应均表现为负值。

由表可知，NCOA1基因的加性效应在初产和经产母猪的总产仔数、总活仔数和健仔数性状中均表现为正值，但是显性效应却在初产母猪的总活仔数和健仔数性状中表现为负值；RBP4基因的显性效应在初产和经产母猪中总产仔数、总活仔数和健仔数性状中均表现为负值，但是加性效应却在初产母猪总产仔数和总活仔数中表现为正值；基因效应的整体数据说明NCOA1基因具有杂合优势，而RBP4基因具有纯合优势，其部分反常表现均集中在初产母猪群体，可能与母猪的首次分娩的生理体征有关。

表3 NCOA1和RBP4的基因效应Tab.3 Gene effects of NCOA1and RBP4

注：TNB为总产仔数、NBA为总活仔数、NHB为健仔数，a为加性效应，d为显性效应，D为显性度，下同。

2.4 NCOA1和RBP4基因型对初产大白猪繁殖性能的影响

根据GLM(广义线性模型)的最小二乘法，计算了不同基因型以及组合基因型对母猪总产仔数、总活仔数、健仔数、死胎、木乃伊、初生窝重的大小，并对其做了差异显著性检验(表4)。由于NCOA1基因BB型个体只有1个，不具有统计学意义，应该舍弃该基因型。

在初产母猪群体中，统计发现：NCOA1基因的总产仔数、活仔数、健仔数、死胎数和初生窝重都为AB型>AA型，而木乃伊数结果相反；RBP4基因在总产仔数、活仔数方面均表现为BB型>AA型>AB型,且在BB型总产仔数显著高于AB型0.57头(P<0.05)。对于NCOA1和RBP4的合并基因型，AABB型的总产仔数显著高于AAAB型(P<0.05)，总产仔数的优势组合ABBB型比AAAB型总产仔数高出0.85头；ABAB型在活仔数、健仔数和初生窝重方面均表现为最优合并基因型，而AAAB型相反；ABBB型的死胎数比AAAB型高出0.34头(P<0.05)。

表4 NCOA1和RBP4基因型对初产母猪繁殖的影响Tab.4 Effect of NCOA1and RBP4genotypes on reproduction of primiparous sows

注：表格中的数值为平均值±标准误；肩标有相同字母或无字母代表差异不显著(P>0.05)，小写字母不相同代表差异显著(0.01

2.5 NCOA1和RBP4基因型对经产大白猪繁殖性能的影响

在经产母猪群体中，NCOA1基因的总产仔数、活仔数、健仔数、木乃伊数、死胎数和初生窝重都为AB型>AA型；RBP4基因在总产仔数、健仔数和初生窝重方面均表现为AA型>BB型>AB型,且AA型健仔数极显著高于AB型0.43头(P<0.01),AA型初生窝重极显著高于AB型0.67千克(P<0.01)。对于NCOA1和RBP4的合并基因型，ABBB型的总产仔数、活仔数、死胎数均高于AAAB型且分别达到极显著、显著和极显著水平(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，总产仔数、活仔数、死胎数分别高出0.85头、0.72头、0.19头；ABBB型的死胎数与极显著高于AAAA、AAAB、AABB型(P<0.01)；AAAA型个体的初生窝重比AAAB型高0.82千克(P<0.01)(表5)。

3 讨 论

3.1 NCOA1基因对大白母猪繁殖性能的影响

在本研究中以685头初经产母猪为研究对象，发现初产母猪中AA型590胎、AB型94胎、BB型仅有1胎；在2164胎经产母猪中AA型1852胎、AB型308胎、BB型仅有4胎。与本文类似的是，李永辉等[11]在试验猪群中未检出BB型个体，吴华莉等[12]在试验猪群中检测出BB型个体数极少。以上结果提示NOCA1基因的BB型个体可能在胚胎期致死、流产，也可能已经在现代猪育种过程中对优势基因的选择、劣势基因的淘汰选择压的人为影响，但还需要进一步证实。

李永辉等[11]发现在长白猪和大白猪中总仔数和健仔数都呈现AA型>AB型>BB型，吴华莉等[12]发现杜洛克和大白群体内总产仔数、总活仔数和初生窝重都表现AA型>AB型>BB型的趋势。但在本试验母猪群体中发现NCOA1基因型对初产母猪的繁殖性能没有显著影响，在经产母猪中AB型总产仔数显著高于AA型，其原因可能是其研究受母猪群体影响。而在水貂的研究中，霍自双等[13]研究结果发现NCOA1基因的总产仔数和产活仔数上呈现为BB型>AB型>AA型的趋势,AB基因型个体的总产仔数和产活仔数均极显著高于AA基因型(P<0.01)。

上述结果表明NCOA1对多个物种的繁殖均有影响，但在不同的物种和群体之间结果存在差异，而针对特定群体的遗传改良可能需要对特定群体进行研究。

3.2 RBP4基因对大白母猪繁殖性能的影响

在本研究中，RBP4基因经产母猪的总产仔数、健仔数、初生窝重均表现为AA型>BB型>AB型，且AA型个体的健仔数、初生窝重极显著高于AB型(P<0.01)，与翟腾蛟等[9]以及朱朋等[14]研究结果相一致。但是，胡闪耀等[15]研究发现母猪的总产仔数和健仔数均表现为BB型个体高于AA型个体，与本研究结果不一致，这可能是因为环境效应或群体遗传背景的差异等因素造成。昌文林等[16]研究发现RBP4在在大白猪群体中,AA基因型母猪比BB基因型母体每窝次平均多产0.94头仔猪,与本试验的经产结果相符，但是初产的总仔数和活仔数存在差异，这一结果可能受初产母猪繁殖生理特征有关。上述结果提示RBP4在不同猪群体中的影响也表现出差异。

3.3 NCOA1和RBP4合并基因分析对大白母猪繁殖性能的影响

关于NCOA1和RBP4的合并分析尚未见报道，在初产母猪中，总产仔数最优组合基因型为ABBB，活仔数、健仔数和出生窝重最优组合基因型为ABAB，而AAAB型在上述4个性状中均表现最差；在本文中发现ABBB型在经产母猪中的总仔数、活仔数、健仔数和出生窝重上也是最优基因组合，而AAAB型的经产母猪则最差。

综上所述，在此大白猪群体中：ABBB型为初产和经产母猪最优合并基因组合，AAAB型为初、经产母猪最劣基因组合，在此群体的选育和实际生产中可利用NCOA1和RBP4作为分子标记进行淘汰或选配，提高猪群整体繁殖性能。